巨噬细胞与单核细胞的细胞骨架调控相关的差异基因表达*

宋咏刚，胡文慧，余鹏，石玉玲，赵雪，胡祖权，王赟，曾柱, 3***

(1.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学 贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心 生物与医学工程重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州医科大学 生物与工程学院，贵州 贵阳 550025)

巨噬细胞(macrophages,Mφ)是一类具有强大抗原吞噬和呈递能力的免疫细胞，具有吞噬作用和杀死入侵的病原体、释放炎症和愈合的介质、抗原呈递和加工等功能[1]。体内的巨噬细胞通常由单核细胞(monocytes,Mo)分化发育而来[2]，Mφ和Mo共同构成单核吞噬细胞系统，在先天性免疫应答和适应性免疫应答中扮演着重要角色。相比于Mo，Mφ具有更强的吞噬功能和呈递抗原的能力，其中的原因值得关注。Vogel等人[3]的研究表明，Mo向Mφ的分化过程中，Mφ可能通过细胞骨架重组和黏附相关分子的表达调节其免疫学功能。因此，本研究从生物信息学角度出发，对Mφ和Mo的细胞骨架相关差异表达基因进行分析，为进一步理解Mφ的免疫调节功能提供依据。

1 资料和方法

1.1 资料

登录美国国家生物技术信息中心(national centerfor biotechnology information,NCBI)的GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，geo dataset)，检索array芯片数据GSE11430并下载，该数据包含5例Mo和5例Mφ的样本资料。

1.2 方法

1.2.1分析芯片数据差异基因 使用R studio软件affy Package对原始数据文件进行标准化处理，并检验归一化处理的结果。使用limma Package筛选表达有显著差异的基因(differentially expressed genes,DEGenes)，以Log|FC|≥2并且P<0.05作为筛选标准[4]。

1.2.2构建蛋白质相互作用网络 登录STRING在线工具(https://string-db.org/)对筛选出的DEGenes构建蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network, PPI)[5]，将结果导入Cytoscap软件，使用“MCODE”插件对该相互作用网络进行K核解析(k-core decomposition)，筛选出DEGenes的核心模块[6]。

1.2.3GO和KEGG富集分析DEGenes的核心模块 对筛选出的DEGenes的核心模块进行基因本体论(GO)富集和京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径分析，统计和数据可视化由RStudio中的ClusterProfiler Package执行，筛选条件为P<0.05 并且基因数目>2[7]。

2 结果

2.1 经RStudio软件获得DEGenes

芯片数据(GSE11430)经分析获得Mφ相对于Mo的差异表达基因共476个(Log|FC|≥2,P<0.05)，其中上调基因300个，下调基因176个，由于篇幅有限，本论文按log FC大小选取上调与下调差异前5的基因，部分基因名及对应信息见表1。

表1 Mφ与Mo的部分差异表达基因Tab.1 The partial differential expression of Mφ to Mo

2.2 构建PPI

使用蛋白质互作网络在线分析工具STRING绘制DEGenes的PPI。结果用CYTOSCAPE软件进行分析，使用“MCODE”插件对该相互作用网络进行K 核解析(k-core decomposition)，以软件自带默认算法，筛选出12组子网络，由于篇幅有限，本论文展示其中最稳定的子网络作为核心模块进行分析，核心模块包含30个节点基因和 215条相互作用关系对(图 1)，其中CEP55、MCM6和CCR2等基因与细胞骨架及其调控相关。

注：A为差异表达基因的蛋白质互作用网络，B为核心模块。图1 差异表达蛋白的核心模块相互作用网络Fig.1 Core module interaction network of differential expression protein

2.3 GO和KEGG富集分析DEGenes

使用RStudio软件clusterProfiler Package对筛选出的476个DEGenes进行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析显示有464个富集结果，将部分结果进行可视化处理(图2)，其中粒细胞迁移(GO 编号 0050900, leukocyte migration)和中性粒细胞活化参与免疫反应(GO 编号0002283, neutrophil activation involved in immune response)2个GO富集涉及细胞骨架的调控；KEGG富集分析有14个通路被富集(图3)，使用RStudio软件pathview Package 对分析出的KEGG结果进行可视化，提示NOD样受体信号通路(编号hsa04621, NOD-like receptor signaling pathway)和吞噬体信号通路(编号hsa04145, Phagosome signaling pathway)与细胞骨架的调控密切相关(图4-5)。

图2 差异表达基因的GO分析Fig.2 GO analysis of differentially expressed genes

图3 差异表达基因的KEGG分析Fig.3 KEGG analysis of DEGenes

图5 KEGG分析中的吞噬体通路Fig.5 The phagocytic pathway in the KEGG analysis

3 讨论

近年来，随着生物芯片、测序和数据分析技术的发展，通过生物信息学对数据的分析，能挖掘出生物过程中起主导作用的相关分子。Mφ在体内可以经Mo分化而来，共同组成单核吞噬细胞系统，不同于Mo，Mφ主要能迁移到炎症或肿瘤发生部位，经吞噬、呈递抗原后激活T细胞[8-10]。细胞骨架主要由微丝、微管及中间纤维构成，是Mφ变形和迁移能力的重要结构基础。有研究表明，在从Mo分化为Mφ的过程中，Mφ的吞噬和运动能力较前者发生了较大的改变，从而导致Mφ独特的免疫学功能的产生[11]。因此，本研究从生物信息学角度出发，分析在Mo分化为Mφ过程中细胞骨架调节相关的差异基因的表达。本研究对差异基因核心模块结果分析发现，有多个核心差异基因参与细胞骨架的调节过程，其中CEP55可以与PLK1联合作用调节细胞骨架重组，从而影响细胞在G1期对细胞外基质的粘附作用[12]。MCM6在细胞骨架的重组，DNA稳定和甲基化模式中起重要作用[13]。CCR2和MCP1的共同作用下，导致肌动蛋白重组和应力纤维的产生，使细胞的迁移能力增强[14]。

GO注释是把DEGenes的变化归纳到代谢、细胞通讯、蛋白转运、细胞周期、发育和免疫应答相关等的生物过程中分析方法[15]，本研究发现多个GO功能富集涉及细胞骨架及其调控因子，在粒细胞迁移中，CCL18通过PITPNM3的表达和NF-κB信号通路的激活参与细胞骨架的调控，进而增强细胞的迁移能力[16]。CXCL8通过与G蛋白偶联受体(g protein-coupled receptors,GPCRs)家族的CXCR1和CXCR2相互作用激活Rho激酶通路、调节细胞内钙离子的释放和整合素的表达影响肌动蛋白骨架的重组，导致中性粒细胞的迁移和活化[17]。在中性粒细胞活化参与免疫反应中，C3可以和Rho A相互作用，Rho A可通与活性GTP和非活性GDP结合状态之间的分子转换来调节下游效应子，当被鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEF)家族激活时，RhoA蛋白随后促进细胞中肌动蛋白纤维的组装导致细胞的迁移[18]。CD59与GM1脂筏的聚集有关，GM1脂筏的聚集可以控制许多T细胞活化和调节β1整合素功能，导致和基底的细胞粘附增强，F-肌动蛋白的定位增加改变了细胞刚性、抗剪切能力和细胞形态[19]。

KEGG分析结果显示，NOD样受体信号通路和吞噬体信号通路与细胞骨架的调控密切相关。其中，NOD样受体信号通路中的NOD2是先天免疫系统的模式识别受体，NOD2能与通过脚手架激酶受体相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP2)来激活NF-κB和MAPK途径[20]，MAPK 和 p38调节微管蛋白表达，使胞骨架重排导致Mφ的迁移[21]。吞噬体信号通路(编号hsa04145,Phagosome signaling pathway)对Mφ的免疫功能有重要调节作用，其中Coronin1 蛋白处于肌动蛋白调节的中心，其协调Rac1激活影响肌动蛋白活性，产生片状伪足使细胞迁移及吞噬抗原功能的产生[22]。因此，我们推测，分化过程中细胞骨架的重组对于 Mφ免疫功能的正常执行至关重要。

综上所述，Mo向Mφ分化过程中细胞骨架调控相关基因的表达发生了显著改变，这可能与Mφ的免疫功能直接相关，为进一步理解Mφ的免疫调节功能奠定了理论基础。