基于静电纺丝人脐带华通胶构建组织工程软骨的实验研究

李豪 徐勇 夏会堂 周广东 姜格宁 李承德

由于体内软骨再生能力有限，使得创伤、肿瘤等引起的软骨缺损成为临床治疗中的难题[1]。近年来，组织工程技术的兴起为软骨缺损的修复带来了新的希望[2]。组织工程主要包括三大要素：支架材料、种子细胞和生长因子。缺乏理想的支架材料是组织工程发展亟待解决的难点[3]。

天然材料具有生物相容性优良，细胞毒性小，成分接近天然软骨等优点。软骨细胞外基质来源的支架基质成分及其比例，与天然软骨更为接近。但人源性软骨细胞外基质来源有限，且其结构致密不利于脱细胞处理，严重限制了组织工程软骨的应用与发展[4]。

研究发现，脐带华通胶富含胶原、透明质酸和糖胺聚糖等成分，且无血管分布、神经支配和淋巴回流。此外，华通胶保护脐带血管，防止其受外力挤压，从而保障了正常的脐带血运。该作用与关节软骨缓冲受力，减少变形、损伤及摩擦的作用相似。由此可见，华通胶在成分、结构、功能上均与软骨组织非常类似。此外，脐带华通胶还具有以下特点：①可支持华通胶间充质干细胞的增殖，故也可能支持其他干细胞增殖；②华通胶中透明质酸广泛表达CD44 受体，而软骨细胞也表达CD44，使得软骨细胞能很好地黏附在华通胶上；③华通胶是多肽生长因子储存库，这些生长因子有利于细胞的增殖分化及细胞外基质的重塑；④脐带是分娩废弃物，不涉及伦理问题，来源丰富。因此，华通胶被认为是软骨组织工程支架材料的理想来源[5-7]。

本研究将脐带华通胶混合聚己内酯（Polycaprolactone，PCL）进行静电纺丝，以形成具有一定力学强度和孔隙率的纳米纤维膜，并将该膜复合软骨细胞后植入裸鼠皮下，拟在裸鼠体内培养6 周，以期能成功构建较成熟的组织工程软骨组织。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

胰蛋白酶、高糖DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素-两性霉素B、磷酸盐缓冲液（Hyclone 公司，美国）；DNA 含量检测试剂盒（天根生化科技有限公司），总胶原蛋白检测试剂盒（北京博蕾德生物科技有限公司），透明质酸染色试剂盒（北京雷根生物科技有限公司）。

磁力搅拌器（巩义予华仪器有限责任公司）；精确微量注射泵（LSP01-1A，保定市兰格恒流泵有限公司）；静电纺丝仪器（KDS-100 型，美国Le-Parmer公司）；静电纺丝高压电源（天津市东文高压电源厂）；真空冷冻干燥仪（上海实验室仪器有限公司）；场发射扫描电子显微镜（S-4800 型，日本JEOL 公司）。

1.2 实验动物

6 周龄新西兰白兔10 只（上海甲干生物科技有限公司），雌雄不限；5 只BALC/c 裸鼠，雌雄不限。本实验遵守实验动物伦理原则。

1.3 制备脱细胞的人脐带华通胶

在不违反医学伦理的情况下，收集新鲜健康的人脐带。无菌条件下，去除脐带内的动静脉，剥除脐带外面的膜，可获取胶冻样组织。把获得的华通胶置于1 N NaOH 溶液中，室温条件下脱细胞处理4 h，冰醋酸调节pH 值至7.0 备用。

1.4 生物化学检测

将样品（脱细胞前后标本）置于木瓜蛋白酶溶液（Sigma-Aldrich）中于65 ℃消化12 h。乙醇提取和吸附柱吸附后，在洗脱缓冲液中回收基因组DNA。用核酸蛋白质定量检测器（Nanodrop 2000）检测DNA含量。用羟脯氨酸测定法检测总胶原含量。通过碱水解制备样品，根据先前描述的方法测定游离羟脯氨酸水解产物。以上所有样品的分析重复3 次。

1.5 制备粉末状人脐带华通胶

将上述脱细胞后的华通胶加入匀浆机内，然后加入5 倍体积的无菌三蒸水，4 ℃下充分搅拌粉碎，即可制成华通胶匀浆。将匀浆放入-20 ℃冰箱冷冻过夜，再放入真空冷冻干燥箱中干燥48 h 后与胃蛋白酶按1:50 质量比混合，溶于0.5 mol 醋酸溶液（pH 2.8～3.0），放入37 ℃摇床48 h；将溶液放入离心机，4 ℃、3 500 r/min 离心5 min，收集上清液于新的离心管中，缓慢滴加NaOH 溶液调节pH 到7 左右。将溶液-20 ℃冰箱冷冻过夜，再放入真空冷冻干燥箱中干燥48 h，得到华通胶粉末。

1.6 静电纺丝

秤取等质量的华通胶粉末与PCL 粉剂溶于六氟异丙醇，调节质量体积比为12%，配置华通胶/PCL溶液。将该溶液置于精确微量注射泵中，连接静电纺丝仪器，接通静电纺丝高压电源。调整静电纺丝参数：电压15 KV，推进速度0.6 mL/h，接收距离15 cm，室温25 ℃，环境湿度40%～50%；进行混合静电纺丝，以铝箔接收。将上述所得静电纺丝置入含有25%戊二醛蒸汽的密闭容器皿中熏蒸30 min，以达到充分交联，最终真空冻干24 h 取出备用。

1.7 大体和微观形貌表征

将纳米纤维电纺膜裁减为直径1 cm 的圆片，以观察大体形态。将该纳米纤维电纺膜喷金后，扫描电镜观察其结构特点及纳米纤维排布情况。

1.8 原代软骨细胞的分离培养及扩增

无菌条件下取2 月龄新西兰兔的耳软骨，用眼科剪将软骨块剪至极小块，加入Ⅱ型胶原酶，用吸管充分吹打混匀后，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中消化8 h；加入8 mL 的H-DMEM 培养液（含10% FBS，下同）终止消化，充分吹打混匀后收集至15 mL 的离心管中，以1 800 r/min 离心5 min，弃上清，加7 mL 培养液，充分吹打混匀，取混悬液，分装至培养瓶中，置培养箱培养。24 h 后进行首次换液，此后隔日换液。显微镜下观察细胞生长情况，当细胞生长面积达到培养瓶底部的70%～80%后，用胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。取第2 代细胞备用。

天理图书馆收藏17号敦煌写卷，主要来自李盛铎、许承尧、张大千等旧藏，其中张大千旧藏构成了天理图书馆藏品的主体。这批文献的主要内容是汉文佛典，还有藏文、回鹘文等佛教、道教经典，以及论语、诗经、开蒙要训、社司转帖、本草等残卷等。除写本外，该馆还藏有大谷探险队带回的敦煌纸本绘画“玄奘三藏像”，但入藏途径尚未明。

1.9 纳米纤维膜的细胞相容性

将第2 代软骨细胞制备成1.0×105cells/mL 的细胞混悬液，均匀接种于支架上，37 ℃、5%CO2、饱和湿度下放置4 h，随后加入8 mL 的H-DMEM 培养液培养，隔日换液。分别于体外培养的第1、5、9 天进行活死细胞染色和CCK-8 定量检测，检测方法参照试剂盒说明书。

1.10 软骨细胞-纤维膜复合物体内培养

将第2 代软骨细胞制备成1.0×108cells/mL 的细胞混悬液，均匀接种于支架上。采用“三明治”模型将软骨细胞-纤维膜叠加4 层，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度下放置4 h。5 只BACL/c 裸鼠麻醉后，将4 层结构的软骨细胞-纤维膜复合物植入背部腔隙中，缝合伤口。术后分笼饲养，自由活动。于术后6 周取材检测。

1.11 组织学检测

大体观察脱细胞前后的标本和体内培养6 周的标本，然后将标本以4%多聚甲醛固定24 h，脱水、石蜡包埋、切片（厚度为5 μm）。分别行透明质酸和天狼猩红染色，观察华通胶是否富含透明质酸成分和胶原成分；HE 染色及Safranin-O 染色，观察组织结构及细胞外基质分泌情况。免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达情况，进一步证明构建组织的软骨表型。

1.12 统计学分析

采用GraphPad Prism 软件（Version 5.00，Graph-Pad Software，美国），数据以（）表示，组间比较采用非配对t 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人脐带华通胶成分

脐带是胎儿和胎盘之间的连系结构，形状如绳索，表面光滑透明，内含结缔组织和1 支脐静脉、2根脐动脉（图1a）。Safranin-O 染色显示华通胶富含GAG 成分（图1b）；透明质酸染色显示华通胶富含透明质酸成分（图1c）；天狼猩红染色显示华通胶富含胶原成分（图1d）。

图1 人脐带大体观察和华通胶组织学观察Fig.1 Gross observation of human umbilical cord and histological observation of human Wharton's jelly

2.2 人脐带华通胶基质脱细胞处理

剪碎后的华通胶基质呈白色胶冻样（图2a），经脱细胞处理后，华通胶基质大体形状基本不变，色泽变为浅黄色（图2b）。DNA 定量检测显示，脱细胞后DNA 含量比脱细胞前明显减少，证实细胞成分基本去除（图3c）。同时，胶原含量检测显示脱细胞后胶原成分略有下降（图2d）。

图2 人脐带华通胶脱细胞前后对比Fig.2 Comparison of Wharton's jelly before and after decellularization

2.3 静电纺丝

图3 静电纺丝Fig.3 Electrospun

2.4 细胞相容性

软骨细胞接种于纤维膜后，活死细胞染色显示细胞可以黏附、存活，并且稳定增殖（图4a）。CCK-8细胞增殖曲线结果显示细胞可稳定增殖（图4b）。

图4 静电纺丝纤维膜的细胞相容性Fig.4 Biocompatibility of electrospinning membrane with chondrocytes

2.5 体内软骨再生

裸鼠皮下培养6 周后的组织学显示，在纤维膜之间有大量软骨细胞外基质和特异性软骨陷窝形成，并且纤维膜有一定程度的降解（图5a、b）。Ⅱ型胶原免疫组化证实新生组织为软骨组织（图5c）。

图5 体内软骨再生Fig.5 Cartilage regeneration in vivo

3 讨论

软骨损伤在临床较为常见，但软骨自我修复能力有限，而目前的一些传统方法尚无法获得满意的治疗效果。应用组织工程技术构建组织工程软骨被认为是目前较有前景的治疗手段。但迄今为止，构建的组织工程软骨仍无法真正地应用于临床治疗。

理想的支架材料是制约软骨组织工程临床转化的核心难点。理想的支架材料应该最大程度模仿软骨细胞外基质[8-9]。因此，同种异体软骨脱细胞处理的软骨细胞外基质被认为是组织工程最佳的成分仿生软骨组织工程支架材料。但是，由于来源受限，且结构致密不利于脱细胞处理以去除其免疫原性，一定程度影响了其临床应用。

人脐带华通胶富含透明质酸、糖胺多糖及胶原等，还包含很多生长因子，诸如胰岛素生长因子、碱性成纤维生长因子、转化生长因子β、血小板生长因子、表皮生长因子和其他细胞外基质蛋白。这些生长因子和细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）蛋白为种子细胞提供结构支撑，促进其黏附、增殖，还能提供保持细胞表型的微环境。人脐带华通胶成分与天然软骨ECM 类似，而且人脐带华通胶来源的间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力[10]。研究发现，脐带和软骨组织有许多相似之处：组织内无毛细血管，营养获得来源于组织渗透；基质中含有大量GAG、胶原及透明质酸成分，这与本研究结果一致。因此，可以推测人脐带细胞外基质和人软骨ECM 一样，能很好地促进软骨细胞的增殖和细胞表型的维持。本研究通过NaOH 溶液对脐带华通胶进行脱细胞处理，结果显示，在保证去除绝大部分DNA 的情况下，保留了大量的胶原成分，可作为软骨再生的支架材料[11]。

我们的前期研究表明，华通胶的力学性能较弱（经过脱细胞处理后力学性能变得更弱），且降解速度过快，与软骨基质生长速度不匹配。PCL 是最常用的合成材料之一，已被FDA 批准在临床中运用[12-13]。PCL 具有机械性能强、降解慢、生物相容差的特点。因此，PCL 与华通胶混合后可取长补短，最大限度发挥各自的优点。

静电纺丝纳米纤维具有以下特点：①与天然软骨ECM 相近的微观构造，使制备的支架能够仿生天然ECM 的结构特点；②极高的比表面积，为活性因子的有效释放提供了理想平台；③简便快捷、成本低廉、结构可控。因此，静电纺丝纳米纤维被认为是理想的组织工程支架材料。本研究采用华通胶与PCL混合后进行静电纺丝，制成的混合纤维膜结构上更加接近天然ECM，更有利于种子细胞的黏附、增殖及分化[14-16]。

理想的软骨组织工程支架材料应该具有良好的细胞相容性，并且能支持软骨再生。本研究将软骨细胞接种于华通胶/PCL 静电纺丝纤维膜，体外活死细胞染色及CCK-8 细胞增殖曲线均证实该纤维膜具有良好的细胞相容性，能够支持软骨细胞的黏附、生长及增殖。将软骨细胞-纤维膜复合物植入裸鼠皮下6 周后，组织学证实可再生出典型的软骨组织。以上结果均证实华通胶/PCL 静电纺丝纤维膜适合作为组织工程软骨再生的支架材料。

综上所述，本实验制备的华通胶/PCL 静电纺丝纤维膜免疫原性低、无细胞毒性作用，有细胞生长需要的糖胺聚糖、胶原和生长因子等成分，能够很好地促进软骨细胞的增殖。此外，由于华通胶属于脐带的废弃物，来源广泛，操作简便，而且不存在伦理学问题，因此是一种理想的软骨组织工程支架材料来源。下一步我们将应用该纤维膜对软骨缺损进行修复，以期探索其功能性修复软骨缺损的可行性。