关于胆囊结石、胆囊结石合并胆总管结石、胆总管结石抗生素抗性基因的初步研究

杨晨瑞 李君剑 张燕忠

(1 山西医科大学，太原 030001；2 山西大学，太原 030001；3 山西医科大学附属人民医院，太原 030001)

近年来，由于抗生素的滥用而导致大量耐药性致病菌的出现引起了人们广泛关注，抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作为细菌耐药性的主要原因常被作为研究对象。目前，公认的ARGs的主要作用机制可以包括以下几种：①调节细菌细胞壁发生渗透性改变，从而限制抗生素与靶位相结合；②编码产生外排泵将抗生素主动排除菌体细胞外；③对抗生素进行酶修饰；④编码产生的蛋白酶直接降解抗生素；⑤使菌体产生代谢旁路，使抗生素对菌体新陈代谢的抑制作用失效；⑥调节修饰抗生素的作用靶位；⑦调节抗生素作用靶位的合成水平，使靶位相对“过剩”；⑧形成生物膜[1-2]。并且，由于ARGs兼具“可复制或传播”的生物特性和“不易消亡或环境持久”的物理化学特性，ARGs在生物体内可长久而持续地传播，即使携带ARGs的细菌被人体免疫系统杀灭或消亡，但它释放到环境中的DNA与黏土、矿物质和腐殖质物质相结合时，将逃脱核酸酶的降解，在环境中存留的时间更长[3]，并可能通过直接接触或污染食物链等多种途径进入人体，增加了人类治愈细菌感染性疾病的风险，严重威胁人类健康[4-5]。

胆石病(cholelithiasis)包括胆囊和胆管的结石，是常见病和多发病。随着人民生活水平的提高，我国胆石病的种类和发病率也出现了很大变化。目前，我国胆囊结石的发病率已达10%[6]，国外文献报道9.2%～33.0%的胆囊结石患者中存在胆总管结石[7]，腹腔镜胆囊切除后又并发胆总管结石的总体发生率维持在3%～10%之间[8]。目前，胆囊结石以腹腔镜胆囊切除为主，胆囊结石合并胆总管结石以(胆囊切除+胆道切开探查+T管引流术)为主，胆总管结石以开腹胆总管取石T管引流术为主，而胆道手术后最严重的并发症之一就是感染[9]。常常引起临床急症，是一种潜在的威胁生命的疾病。并且由于手术位置及生理的特殊性，容易产生耐药菌株，使如何为手术后患者选择合理有效的抗生素治疗成为一个难题。因此，了解人体内ARGs的携带状况，可以对临床工作中合理选择抗生素提供帮助。

目前，国内抗生素抗性基因污染的研究相对集中于水产养殖、河流污染、动物粪便等[10]。对于人体内ARGs的研究却很薄弱。鉴于这一研究较少，本文主要对胆道系统内的ARGs进行了检测，期望为人体内ARGs的研究和进展提供帮助，同时也为抗生素的合理选用提供一定对策。

1 实验材料与方法

1.1 样品采集

收集胆囊结石30例(A组)、胆囊结石合并胆总管结石30例(B组)、胆总管结石30例(C组)，采集时间(2017年10月—2018年6月)。结石标本取出后直接放入无菌袋中，并直接送与实验室，置于-20℃冰箱中储存。

入选标准：(1)胆囊结石均为行LC手术、胆囊结石合并胆总管结石及胆总管结石均为开腹手术、术前B超及MRI确诊(并且术中证实存在结石)；(2)无严重心、脑、肾等其他重要器官原发病；(3)状态良好，可耐受外科手术；(4)对治疗相关药物无过敏并耐受；(5)临床资料完整；(6)对本研究表示理解和支持并签署知情同意书。

排除标准：(1)发性硬化性胆管炎患者；(2)肝硬化患者；(3)胰腺癌、胆管癌患者；(4)胆道良性狭窄患者；(5)肝移植患者；(6)免疫功能低下，存在其他部位感染者；(7)正在接受糖皮质激素治疗的患者。

1.2 DNA的提取

样品的基因组提取使用E.Z.N.A®Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek, USA)，按照生产商的说明操作，用多功能读版机Infinite 200 PRO(TECAN, Sweden)测定DNA浓度和纯度。每个样提取3份，然后将3份DNA提取物合并在一起于-20℃保存待用。

1.3 实时荧光定量PCR

对对照样品进行了高通量qPCR，共检测出175种ARGs，根据其丰度大小及查阅相关文献[11-12]，共选取了其中17种ARGs，具体包括β-内酰胺类抗生素抗性基因10种(blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaampC、ampC-01、ampC/blaDHA、bla-ACC-1、blaCMY、blaGES和cfxA)，氨基糖苷类抗生素抗性基因5种(aac、aacC、aadD、aadA1和strB)，四环素类抗生素抗性基因1种(tetX)，磺胺类抗生素抗性基因1种(sull)，以及1种整合酶基因(intI1)和1种转座酶基因(tnpA)进行qPCR检测，同时对细菌16S rRNA基因进行qPCR检测，这些ARGs在qPCR检测中所用引物序列见(表1)。含有这些特定基因的质粒由浙江天科生物技术有限公司生产，作为qPCR标准曲线10倍稀释的标准品，并以无菌水作为阴性对照。将标准品与待测样品一起在StepOnePlus™实时荧光定量PCR仪器上进行qPCR。所有样品3个平行，最终计算平均值。

qPCR反应体系采用10μL体系，包括TB Green Premix ExTaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)5μL，上下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye(50×)0.2μL，DNA Sample，1μL，ddH2O，3μL。反应热循环步骤如下：(1)95℃，30s，1cycle；(2)95℃，5s，40cycles；(3)60℃，30s，40cycles。CT检测限为40个循环。通过熔解曲线和凝胶电泳验证引物特异性。

表1 抗生素抗性基因的引物序列Tab.1 primer sequences of antibiotic resistance genes

1.4 数据分析

数据采用Microsoft Excel 2013和SPSS 17.0进行处理和分析，作图采用Microsoft Excel 2013、SigmaPlot 14.0、R 3.5.1及Gephi等完成。用单因素方差分析(one-way ANOVA)对不同部位ARGs的差异性进行分析。用Pearson线性相关分析确定MGEs和ARGs丰度之间是否具有显著相关性。

2 结果

2.1 16S rRNA、整合酶基因(intI1)、转座酶基因(tnpA) 的丰度

在该研究中，对胆囊结石、胆囊结石合并胆总管结石、胆总管结石中的16S rRNA、整合酶、转座酶进行荧光定量PCR检测(图1)。本研究发现胆总管结石中的16S rRNA和整合酶基因(intI1)、转座酶基因(tnpA)相对丰度均要高于其余两组，但16S rRNA基因相对丰度与胆囊结石合并胆总管结石相比没有差异，与胆囊结石之间相比有显著差异。整合酶基因(intI1)相对丰度与胆囊结石合并胆总管结石、胆囊结石之间相比均有显著差异。转座酶基因(tnpA)相对丰度与胆囊结石合并胆总管结石相比有显著差异，与胆囊结石之间相比没有差异。胆囊结石合并胆总管结石中16S rRNA和整合酶基因(intI1)的相对丰度要高于胆囊结石，但没有显著差异。胆囊结石合并胆总管结石中转座酶基因(tnpA)的相对丰度要与胆囊结石之间相比较低，但没有显著差异。

图1 胆囊结石、胆囊结石合并胆总管结石、胆总管结石中16S rRNA、整合酶、转座酶基因相对丰度比较Fig.1 The relative abundance of 16S rRNA, intI1 and tnpA genes in gallbladder stones, common bile duct stones and common bile duct stones was compared

各类ARGs的比例及所测得的ARGs的相对丰度如图2所示中。胆囊结石中，磺胺类抗生素抗性基因所占的比例最高为48.47%，β-内酰胺类抗生素抗性基因占的比例最低为5.92%，具体测到的ARGs有8种，strB基因检出率最高，为27.1%。blaTEM、cfxA、aacc、aadD、aadA1、tetX、sull的检出率分别为13.9%、5.1%、5.1%、7.7%、20.7%、4.6%和15.6%。胆囊结石合并胆总管结石中，磺胺类抗生素抗性基因所占的比例最高为46.85%，β-内酰胺类抗生素抗性基因占的比例最低为12.94%，具体测到的ARGs有15种，sull基因检出率最高，为17.1%。blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、ampC-01、ampC/blaDHA、bla-ACC-1、blaGES、cfxA、aac、aacc、aadA1、strB和tetX的检出率分别为3.2%、9.4%、4.4%、3.4%、8.9%、4.2%、2.8%、2.5%、8.2%、3.9%、8.1%、6.2%、8.2%和9.4%。胆总管结石中，磺胺类抗生素抗性基因所占的比例最高为32.43%，氨基糖苷类抗生素抗性基因占的比例最低为17.34%，具体测到的ARGs有16种，blaTEM基因检出率最高，为9.1%。blaCTX-M、blaSHV、ampC-01、ampC/blaDHA、blaACC-1、blaCMY、blaGES、cfxA、aac、aacc、aadA1、strB、tetX和sull的检出率分别为7.3%、6.5%、7.6%、5.4%、5.6%、3.3%、6.4%、4.0%、4.5%、4.7%、6.9%、6.1%、6.0%、7.8%和8.9%。blaCMY只在胆总管结石组被测到，aadD只在胆囊结石组中被测到。

在测得的β-内酰胺类抗生素抗性基因中(图3)。胆总管结石中的blaTEM、blaAmpC、blaCMY和blaGES基因的相对丰度均显著高于其余两组；胆总管结石中的ampC-01、ampC/blaDHA基因的相对丰度显著高于胆囊结石，但与胆囊结石合并胆总管结石无显著差异；blaCTX-M、blaSHV、bla-ACC-1和cfxA这3组间无显著差异。尽管在胆囊结石合并胆总管结石中测得的ARGs的相对丰度均要高于胆囊结石(除blaCMY基因未被测到外)，但两者间无显著性差异。blaCTX-M、blaSHV、blaAmpC、ampC-01、ampC/blaDHA、bla-ACC-1、blaCMY、blaGES这些基因在胆囊结石中未被测到。

在测得的氨基糖苷类抗生素抗性基因中(图4)。胆总管结石中的aac、aacC基因的相对丰度显著高于胆囊结石，但与胆囊结石合并胆总管结石无显著差异；胆总管结石中strB基因的相对丰度显著高于胆囊结石合并胆总管结石，但与胆囊结石无显著差异，aadD、aadA1这3组间无显著差异。胆囊结石合并胆总管结石和胆囊结石中测得的ARGs的相对丰度两者间无显著性差异。aac基因在胆囊结石中未被测到，aadD在胆囊结石合并胆总管结石和胆总管结石中未被测到。

在测得的四环素类和磺胺类类抗生素抗性基因中(图5)。胆总管结石中tetX基因的相对丰度要显著高于胆囊结石，但与胆囊结石合并胆总管结石无显著差异。胆囊结石合并胆总管结石中的tetX基因与胆囊结石无显著差异。sull基因这3组间无显著差异。

2.2 抗生素抗性基因(ARGs)与可移动遗传因子(MGEs)的相关性分析

图2 ARGs的相对丰度及之间的比例Fig.2 Relative abundance and ratio of ARGs

抗生素抗性基因(ARGs)和可移动遗传因子(MGEs)之间的相关关系如表2所示。在检测的4类ARGs中，tnpA、intI基因与β-内酰胺类基因、四环素类基因和磺胺类基因均具有显著正相关(P＜0.01)。β-内酰胺类基因与氨基糖苷类基因、四环素类基因和磺胺类基因都具有显著相关性(P＜0.01)。氨基糖苷类基因与磺胺类基因、四环素类基因具有显著相关性(P＜0.01)。四环素类基因和磺胺类基因具有显著相关性(P＜0.01)。

3 讨论

健康人群胆汁内一般无细菌生长，但由于结石、畸形、梗阻、既往手术史等因素致胆道发生病理性改变, 胆道固有的防御、清除机制受到破坏, 细菌异位进入胆道繁殖[13]。有研究发现，胆石症住院患者约有6%～9%会发生胆道感染[14]。抗生素作为治疗感染性疾病的特效药被广泛应用于临床工作中，目前临床治疗感染性疾病时主要依据经验性用药，这极易造成抗生素的滥用，进一步导致耐药菌株的产生，一旦发生重症感染可造成患者全身炎性反应综合征、脓毒症、多脏器功能不全甚至死亡，病死率可高达11%～27%[15]。因此，分析胆石病患者体内ARGs的携带情况，为临床中的药物使用如如何有效预防并控制细菌的感染、如何合理正确的使用药物提拱了重要的科学依据。

在本次研究中，检测到胆石病患者含有丰富的ARGs。其中胆囊结石患者ARGs有8种，胆囊结石合并胆总管结石患者ARGs有15种，胆总管结石患者ARGs有16种。检测到β-内酰胺类抗生素抗性基因在胆囊结石患者和胆囊结石合并胆总管结石患者中占的比例最低，氨基糖苷类抗生素抗性基因在胆总管结石患者占的比例最低。因此，这些发现可以为胆囊结石患者和胆囊结石合并胆总管结石患者首选β-内酰胺类抗生素及胆总管结石患者首选氨基糖苷类抗生素提供理论上的依据。同时，该研究中还发现，在选择的β-内酰胺类抗生素抗性基因中，胆总管结石患者中β-内酰胺类抗生素抗性基因的丰度与种类高于胆囊结石患者和胆囊结石合并胆总管结石患者。对氨基糖苷类抗生素抗性基因检测后发现，除aadD基因在胆总管结石患者为被检测到外，其他氨基糖苷类抗生素抗性基因的相对丰度均要高于胆囊结石患者和胆囊结石合并胆总管结石患者。本次实验也对四环素类和磺胺类抗生素抗性基因进行了检测，发现磺胺类抗生素抗性基因所占比例最高，四环素类次之，这可能与四环素类和磺胺类抗生素曾广泛应用于临床有关。因此，应避免使用这两类抗生素，尽管目前这两类药物临床应用已受到很大限制，但本次研究也为临床抗生素的经验用药的选择提供了理论上的依据。目前研究发现，高温可以有效的的减少堆肥中ARGs的丰度[16-17]，也有研究报道在堆肥中加入中药渣发现ARGs的相对丰度较少了[18]。这些发现对如何可以减低人体内的ARGs的丰度，从而提高人对抗生素的敏感性提供了思路，这也将是我们今后研究的一个主要方向。

图3 胆囊结石、胆囊结石合并胆总管结石、胆总管结石中β-内酰胺类抗生素抗性基因相对丰度比较Fig.3 Comparison of relative abundance of antibiotics resistance genes to beta-lactam in gallbladder stones, common bile duct stones with common bile duct stones and common bile duct stones

图4 胆囊结石、胆囊结石合并胆总管结石、胆总管结石中氨基糖苷类抗生素抗性基因相对丰度比较Fig.4 Comparison of relative abundance of aminoglycoside antibiotic resistance genes in gallbladder stones, common bile duct stones with common bile duct stones and common bile duct stones

图5 胆囊结石、胆囊结石合并胆总管结石、胆总管结石中四环素类和磺胺类抗生素抗性基因相对丰度比较Fig.5 Comparison of relative abundance of tetracycline and sulfonamide antibiotic resistance genes in gallbladder stones, common bile duct stones with common bile duct stones and common bile duct stones

ARGs的出现和传播与整合酶基因(intI1)、转座酶基因(tnpA)密切相关性[19-21]，在我们的研究中也证实了这一发现。Heuer等[22]研究发现ARGs和intI1(P＜0.05)有相关性，说明intI1在ARGs横向转移起到非常重要的作用，也进一步证明了intI1是在ARGs传播中的一个重要途径[23]。在我们的研究中intI1和ARGs之间也表现出显著相关性，并且tnpA与ARGs也表现出显著相关性。但是，Forsberg等[24]也认为ARGs与intI1并没有相关性。这些研究表明，ARGs与可移动基因元件的存在和转移机制是非常复杂的，这需要在将来的研究中进一步探索。

综上，胆石病患者含有丰富的ARGs，胆总管结石携带ARGs最多，胆囊结石合并胆总管结石次之，胆囊结石携带的ARGs最少，同时也发现，胆囊结石患者和胆囊结石合并胆总管结石患者中β-内酰胺类抗生素抗性基因含量最低；胆总管结石患者中氨基糖苷类抗生素抗性基因含量最低。这些发现可以为胆石病患者在临床上选择β-内酰胺类抗生素及氨基糖苷类抗生素提供理论依据。而对于如何可以有效减低人体内的ARGs的丰度，这需要在将来的研究中进一步探索。

表2 抗生素抗性基因和可移动基因元件之间的相关关系Tab.2 The correlations among the abundance of antibiotic resistant genes and mobile gene elements