幼年大鼠静脉注射头孢曲松钠与口服钙剂相互作用的研究

陈建华 欧小兰 郭阳 林雪梅 周春阳 张建武

(川北医学院药学院药理教研室，川北医学院药物研究所，南充 637000)

头孢曲松钠是临床上常用的第三代头孢类抗生素，在儿童、老人及孕妇等特殊群体上得到广泛应用。其在体内几乎不被代谢，并以原形排出体外。其中，大部分头孢曲松钠经肾脏排出体外，其余经胆汁和肠道排泄，故在肾脏和胆汁中药物浓度较高，根据此代谢特点，头孢曲松钠经常用于泌尿系统疾病和肝胆系统感染性疾病的治疗。与此同时，头孢曲松钠的不良反应除了常见的过敏反应，还可诱发肾脏结石[1-4]。

1986年，Schaad等[5]首次报道了注射头孢曲松钠能诱发可逆性泌尿系结石症，此种结石的主要成分是头孢曲松钙盐，一般直径较小，可呈泥沙状，形成速度快，往往呈一过性，很快从尿液中排出体外，所以被命名为“假性结石”，部分患者无明显症状，临床上容易被忽视，绝大多数患者为儿童[6-7]，大部分受结石影响的患者在保守治疗后都没有任何症状，有自愈倾向[7]。但如果没有肾超声检查，这些无症状的结石将不会被发现。因此，头孢曲松引起的肾结石实际发生率可能更高。由于头孢曲松钠是临床上最常用的抗生素之一，因此，在某些情况下，应注意该药物引起的结石，以避免或预防不可避免的肾并发症(如肾衰竭)。

静脉注射头孢曲松钠与含钙注射液不能放在同一容器里混合静脉输注，严重者会发生死亡[8]。正因如此，国家食品药品监督管理局(下简称SFDA)于2007年2月25日以国食药监注[2007]88号文件发出紧急通知：关于修订头孢曲松钠说明书中警示语和注意事项的通知：根据头孢曲松钠与含钙溶液同时使用时产生的安全性不良事件信息，SFDA药品评价中心确定了配伍使用头孢曲松钠与含钙溶液发生不良事件并导致死亡的病例，所有病例均为新生儿或婴儿。为保证头孢曲松钠的安全使用，SFDA决定立即对该品说明书进行修订：对28d及以下的新生儿不得在使用头孢曲松的同时静脉给予钙剂，不得在使用或将要使用含钙的静脉注射药品时给予头孢曲松；对大于28d的患者可以连续使用头孢曲松和含钙溶液，但应在二组输液之间使用可改性的溶液冲管。对于任何患者都不能在Y型管处同时给予头孢曲松和含钙注射液。因为头孢曲松钠为阴离子，极易与阳离子钙形成不溶性沉淀，属化学配伍禁忌。

虽然头孢曲松钠注射液不宜与含钙注射液直接混合已得到证实，但目前尚无静脉注射头孢曲松钠与口服钙剂相互作用的相关研究。因为婴幼儿自身的生理特点，会经常口服钙剂，若发生感染，会使用抗生素。我们设计此课题，希望为婴幼儿的合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验试剂

80只90～130 g左右的雄性清洁级SD大鼠，被随机分配成8组，每组各10只。均购于川北医学院动物实验中心(许可证编号：SYXK(川)2018-076)，动物被饲养于动物中心，饲养间为标准饲养间，温度控制为18～22℃，湿度控制在50%～60%，自由饮食水。头孢曲松钠用生理盐水溶解。

CysC，β2-MG，RBP检测试剂盒，头孢曲松钠标准品(98%)购于上海哈灵生物科技有限公司；钙剂为99%的CaCl2标准品，购于上海邦景实业有限公司；Cr、BUN检测由川北医学院附属医院检验科完成；HE染色由川北医学院附属医院病理科完成。

1.2 实验分组

所有大鼠均于适应性饲养3d后被随机分配成8组。分组如下：①空白对照组：尾静脉给予生理盐水。②钙剂对照组：800mg/kg CaCl2灌胃。③头孢曲松钠+钙剂组：分为3组大鼠，先800mg/kg CaCl2灌胃，然后尾静脉注射分别给予600、400和200mg/kg头孢曲松钠，给药1次。④头孢曲松钠阳性对照组：分为3组大鼠，不给钙剂，尾静脉分别注射600、400和200mg/kg头孢曲松钠。800mg/kg CaCl2的依据：有文献报道给大鼠肌肉注射1000mg/kg头孢曲松钠，然后灌胃800mg/kg CaCl2，肾脏有明显的结石出现[9]。

1.3 实验流程

①先给予幼年大鼠钙剂灌胃，然后尾静脉给予大鼠头孢曲松钠，模拟人使用头孢曲松钠与口服钙剂联用；②实验7d后，处死大鼠，检测肾生化指标Cr、BUN；③肾组织病理检查肾脏的微观形态变化；④因大鼠给药7d后就处死，因此对肾功能影响可能只是肾功能改变的早期，因此采用ELISA检测反映早期大鼠肾功能改变的指标CysC、β2-MG、RBP变化。

1.4 病理切片HE染色

大鼠处死后，观察肾脏颜色，有无肿大，取出后立即称重，计算脏器/体重比。然后从肾盂剖开，观察有无肾盂积水。若有积水，则对输尿管、膀胱进行取材，中性甲醛固定后制作快速冰冻切片及石蜡切片(HE染色)用外科显微镜观察肾脏病理改变及晶体形成。重点观察肾盂有无积水，肾小管有无扩张、结晶形成，肾实质有无炎性细胞浸润。

1.5 ELISA检测CysC、β2-MG、RBP

以CysC为例，其他两个指标类同。CysC试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中CysC水平。用纯化的大鼠CysC抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入CysC，再HRP标记的CysC抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CysC呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(A值)，通过标准曲线计算样品中大鼠CysC浓度。

1.6 统计方法

以上实验所得数据均采用SPSS 19.0软件进行统计分析，各实验组与对照组比较用单因素方差分析，结果用(±s)表示，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏比重(左右肾随机，肾脏重量与体重之比)及生化指标方差分析。

表1～3中所有组n=10。

由表1可知，肾脏比重的单因素方差分析，F=1.875，P=0.138，P＞0.05，差别无统计学意义。

由表2可知，BUN 的单因素方差分析，F=0.979，P=0.389，P＞0.05，差别无统计学意义。Cr的单因素方差分析，F=1.893，P=0.171，P＞0.05，差别无统计学意义。

由表3可知，经单因素方差分析，与生理盐水组相比，CysC、β2-MG、RBP指标组间差别有统计学差异 (P＜0.05)，经LSD法两两比较，CysC、β2-MG、RBP指标在600和400mg/kg头孢曲松钠+钙剂组，600mg/kg头孢曲松钠组间与生理盐水组相比，差别有统计学差异(P＜0.05)。200mg/kg头孢曲松钠+钙剂组RBP与生理盐水组相比，差别有统计学差异(P＜0.05)。

2.2 肾脏病理指标分析

2.2.1 空白对照组

肾脏切面未见明显异常，肾小球、肾小管细胞大小、形态正常，皮髓质边界清楚、胞浆、细胞核染色均匀、细胞核清晰，未见细胞水肿与炎性细胞。

2.2.2 钙剂对照组

表1 所有组肾脏比重的单因素方差分析(±s)Tab.1 One-way ANOVA of renal weight ratio in all groups(±s)

表1 所有组肾脏比重的单因素方差分析(±s)Tab.1 One-way ANOVA of renal weight ratio in all groups(±s)

组别 肾脏比重 F值 显著性高剂量头孢曲松钠+钙组 0.224±0.026 1.875 0.138中剂量头孢曲松钠+钙组 0.227±0.032低剂量头孢曲松钠+钙组 0.228±0.033高剂量头孢曲松钠阳性对照组 0.245±0.031中剂量头孢曲松钠阳性对照组 0.239±0.014低剂量头孢曲松钠阳性对照组 0.233±0.035空白对照组 0.238±0.033钙剂对照组 0.239±0.018

表2 各组肾功能生化指标的单因素方差分析(±s)Tab.2 One-way ANOVA of renal biochemical indexes in all groups(±s)

表2 各组肾功能生化指标的单因素方差分析(±s)Tab.2 One-way ANOVA of renal biochemical indexes in all groups(±s)

组别 BUN/(mmol/L) Cr/(μmol/L) 空白对照组 7.35±1.94 31.48±7.8钙剂对照组 7.16±2.1 32.81±7.56高剂量头孢曲松钠+钙组 7.97±1.96 34.22±6.72中剂量头孢曲松钠+钙组 7.2±1.58 31.77±5.11低剂量头孢曲松钠+钙组 8.3±1.57 33.03±7.76高剂量头孢曲松钠阳性对照组 8.53±2.03 35.79±5.82中剂量头孢曲松钠阳性对照组 7.5±1.96 33.61±4.95低剂量头孢曲松钠阳性对照组 7.83±1.79 32.58±6.67 F值 0.979 1.893 P值 0.389 0.171

表3 早期肾损伤指标各组比较(±s)Tab.3 Comparison of early-stage renal injury indicators in different groups(±s)

表3 早期肾损伤指标各组比较(±s)Tab.3 Comparison of early-stage renal injury indicators in different groups(±s)

"△"：表示与空白对照组相比，P＜0.05；“*"：表示与钙剂对照组相比，P＜0.05。经单因素方差分析的LSD法两两比较，高、中剂量头孢曲松钠+钙剂组，高剂量头孢曲松钠阳性对照组的CysC、β2-MG、RBP指标分别与空白对照组、钙剂对照组相比，差别有统计学差异(P＜0.05△*)。低剂量头孢曲松钠+钙剂组RBP与空白对照组相比，差别有统计学差异(P＜0.05△)。

组别 CysC/(mg/L) β2-MG/(mg/L) RBP/(mg/L)空白对照组 0.82±0.23 1.83±0.76 37.25±8.09钙剂对照组 0.96±0.35 1.53±0.29 45.12±9.68高剂量头孢曲松钠+钙组 1.75±0.41*△ 3.25±0.76*△ 83.65±17.86*△中剂量头孢曲松钠+钙组 1.39±0.60*△ 2.67±0.51*△ 76.37±22.97*△低剂量头孢曲松钠+钙组 1.01±0.58 2.01±0.98 70.46±15.91△高剂量头孢曲松钠阳性对照组 1.52±0.43*△ 2.85±0.96*△ 73.57±14.53*△中剂量头孢曲松钠阳性对照组 0.77±0.61 1.77±1.05 61.60±15.89低剂量头孢曲松钠阳性对照组 0.68±0.55 1.06±0.63 68.56±17.72 F值 5.786 4.951 7.352 P值 0.01 0.03 0.001

肾小球、肾小管结构清晰，未见明显异常。

2.2.3 高剂量头孢曲松钠+钙组

肾脏切面未见明显异常，镜下肾小球充血，肾小管多灶性凝固性坏死，远曲小管上皮细胞水肿，部分大鼠的肾小管有钙盐结晶，肾盂周围有较多淋巴细胞浸润。

2.2.4 中剂量头孢曲松钠+钙组

肾小球充血，肾小管呈局灶性凝固性坏死，近曲小管上皮细胞水肿，间质有少量淋巴细胞浸润。

2.2.5 低剂量头孢曲松钠+钙组

图1 肾脏HE染色Fig.1 kidney stained with HE

肾小球、肾小管结构清晰，未见明显异常。

2.2.6 高剂量头孢曲松钠阳性对照组

肾小球结构未见明显变化，肾小管上皮水肿，间质有少量淋巴细胞浸润。有一只大鼠的肾小管有钙盐结晶。

2.2.7 中剂量头孢曲松钠阳性对照组

有一只大鼠的远曲小管上皮细胞水肿，其余大鼠无异常。

2.2.8 低剂量头孢曲松钠阳性对照组

肾小球、肾小管结构清晰，未见明显异常。

3 讨论

静脉注射头孢曲松钠与含钙注射液不能放在同一容器里混合静脉输注，严重者会发生死亡[8]。因为婴幼儿自身的生理特点，会经常口服钙剂，若发生感染，会使用抗生素。本文希望通过此项研究，能为婴幼儿的合理用药提供依据。

从实验结果可知，头孢曲松钠与口服钙剂联用，可对肾脏造成一定的病理损害，但因为肾脏有强大的代偿能力，且只给药7d，所以对肾功能生化指标Cr、BUN无明显影响，部分大鼠肉眼可看到泥沙样结石。为探讨对早期肾功能是否有损害，我们使用了反映大鼠早期肾功能的指标CysC、β2-MG、RBP[1]，结果显示：高、中剂量头孢曲松钠+钙组，高剂量头孢曲松钠阳性对照组与空白对照组、钙剂对照组相比，CysC、β2-MG、RBP差别有统计学差异(P＜0.05)，低剂量头孢曲松钠+钙组RBP与空白对照组相比，差别有统计学差异(P＜0.05)。高剂量头孢曲松钠+钙剂组和高剂量头孢曲松钠阳性对照组相比，各指标差别无统计学意义，P＞0.05。说明两者联用对肾脏可造成轻微损害，而单用头孢曲松钠600mg/kg也会造成早期肾功能损害。但联用钙剂的头孢曲松组造成肾脏损害的剂量要低于单用的剂量。所以药物浓度是一个很重要的原因，而加入钙剂更容易发生肾脏损害。故两者联用对肾脏具有协同作用，大剂量使用头孢曲松钠，是肾结石的危险因素之一，这和文献报道一致[10]。从肾脏病理HE染色图1d结果可以看出，集合管下有结晶形成。

头孢曲松钠与钙产生相互作用的机理还不是太不清楚。有一种假说认为头孢曲松钠结晶与肾小管细胞间有高的表面黏附力。原因可能是大剂量头孢曲松钠给药(导致尿中头孢曲松钠含量增加)和任何原因引起的尿潴留如炎症引起黏附分子表达(导致头孢曲松晶体在尿路中滞留，允许晶体生长和聚集)，目前黏附的机理还不清楚，一种可能性是头孢曲松/钙晶体可通过离子作用和/或氢键黏附在细胞表面，类似于其他含钙晶体(如草酸钙、磷酸钙)[11]。另一种可能是MDCK细胞表面可能存在一些(未知的)头孢曲松晶体受体。但因为是假说，还有待进一步验证。此外，头孢曲松钠为阴离子，极易与阳离子钙形成不溶性沉淀[12]，都可能促进头孢曲松结石的形成。

本研究因为条件所限，未进行尿钙检测，机制有待进一步探索。本实验只是在动物身上证实两者联用能引起肾脏的早期损害，但尚未进行大规模的临床试验证实。

致谢：向川北医学院附属医院检验科、形态学研究所和病理科提供的帮助给予感谢！