百香果中番茄红素提取工艺优化研究

武广珩，傅仙玉，陈志宾

（1.福建省生态产业绿色技术重点实验室，福建武夷山354300；2.武夷学院生态与资源工程学院，福建武夷山354300；3.武夷学院茶与食品学院，福建武夷山354300；4.中国乌龙茶产业协同创新中心，福建武夷山 354300；）

番茄红素广泛存在于一些植物中，如百香果、番茄、草莓、胡萝卜、番茄等，是一种较为常见的功能性色素，它属于类胡萝卜素中的一种[1]。番茄红素是一种脂溶性有机化合物，易溶于有机溶剂，难溶于水，分子式为C40H56，分子量为536.85 Da，具有11 个共轭双键和2 个非共轭碳-碳双键[2]。番茄红素是目前在自然界中发现的最强的抗氧化剂，它的抗氧化能力比β-胡萝卜素强2 倍以上，比维生素E 强100 倍[3]，还具有消除人体自由基，延缓衰老的作用，因此又有“植物黄金”的美誉[4]。随着研究的深入，发现番茄红素能够有效的预防心血管疾病，对动脉粥样硬化具有延缓作用，能够提高人体的免疫力[5-6]。同时对于多种癌症具有一定的治疗效果[7-8]。最近有研究发现，番茄红素通过增强干扰素途径提高了PD-1 单抗的治疗效果[9]。番茄红素以其极高的药用价值，被认定为A 类营养素，是世界公认的集营养与着色双重作用于一体的功能性食品添加剂[10]。

对于番茄红素的提取方法，王艺璇等[11]对其进行总结，主要有如下几种方法：一是有机溶剂浸提法，其利用的是番茄红素为脂溶性色素，可溶于脂溶性的有机溶剂中，通过选择最佳的有机提取剂，改变提取时间、温度、液料比等来得到它最佳的提取工艺；二是超声提取法，利用超声波的特性来破坏细胞的基质，促进番茄红素的释放，这种方法的提取效率较高、耗能少、浪费少，是一种较为高效的提取方法；三是微波辐射提取法，这种方法的作用机理与超声提取法较为类似，利用电磁波的穿透作用来破坏细胞壁，加快番茄红素的析出，这也是一种高效的新型提取方法。

番茄红素在各类植物的果实中广泛存在，但是在各类的研究以及各种参考文献中，主体的提取材料为番茄、圣女果、西瓜这3 种。在蔡俊等[12]的研究中，用番茄作为提取原料，氯仿作为提取剂，在25 ℃、pH 6.0、90%溶剂用量时提取效果最好。在王海红等[13]的研究中，用圣女果作为提取原料，丙酮∶石油醚=1 ∶1（体积比）作为提取剂，在 28 ℃、液料比 4 ∶1（mL/g）、提取40 min 时，提取效果最好。在孙利祥等[14]的研究中，用西瓜作为提取原料，含有2%二氯甲烷的正己烷作为提取剂，在 25 ℃、料液比 1 ∶3（g/mL）、pH5.5、提取 2 h时提取效果最好。就目前的研究现状来说，对番茄红素提取的原材料方面的研究较少，相对而言番茄红素提取各方面的数据情况还不够完善。

百香果是西番莲科西番莲属的草质藤本植物，人们日常生活中常见的一种水果，基本一年四季都可见到它的身影，它具有一定的药用价值[15]。百香果中的化学成分主要以酚类、黄酮苷类、生物碱等为主，除了抗焦虑、抗疲劳的作用外，还具有抗氧化活性、神经保护等作用，常用于失眠、抑郁、神经紧张等方面的治疗[16-17]。还有研究发现，百香果皮中的可溶性膳食纤维对乙醇所致大鼠溃疡具有保护作用[18]。由于对百香果药用价值的开发相对较少[19]，本试验选择以百香果作为提取材料，一方面可以加强对百香果药用方面的开发，提高百香果各方面的利用率和其利用价值，另一方面可以拓宽番茄红素提取的材料来源，进一步优化对番茄红素的提取。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

百香果：产自福建龙岩。

1.1.2 主要试剂

苏丹Ⅰ色素（分析纯）、丙酮（分析纯）、无水乙醚（分析纯）、氯化钠（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、正己烷（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器

电子分析天平（FA224 型）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；恒温振荡培养箱（ZQWY-218N 型）：上海知楚仪器有限公司；高速离心机（Neofuge 15R 型）：上海力申科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1100）：上海美普达仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄红素提取

切开百香果，取出果肉于研钵中，研磨粉碎，称取所需量的果肉并对其进行预处理，将预处理后的果肉转入三角瓶中，加入提取剂，封口，置于恒温振荡器上，设置试验所需要的温度、时间、转速等进行振荡提取，用滤纸过滤提取液，置于485 nm 波长的可见分光光度计上测量吸光度。

1.2.2 单因素试验设计

1.2.2.1 预处理设计

百香果研磨粉碎后，准确称取10 g 百香果浆液，采用以下方法（表1）对其进行预处理：每个处理重复3 次，对于上述有进行离心的预处理，离心结束后，倒掉上清液，将果肉挖出，放入三角瓶中。预处理结束后，各加入30 mL 丙酮-正己烷2 ∶1（体积比）混合液，放置于35 ℃的恒温振荡培养箱中，以200 r/min 的速度振荡提取2 h。用滤纸对提取液进行过滤处理后，用丙酮-正己烷2 ∶1（体积比）提取剂调零，然后在485 nm波长处测量吸光度。

表1 预处理试验方案设计Table 1 Design of pretreatment test scheme

1.2.2.2 最佳提取剂设计

准确称取5 g 百香果浆液，对其进行最佳预处理；取5 组三角瓶，每组3 次重复，对其进行编号，放入处理好的提取材料；然后在这5 组三角瓶中各自加入15 mL 不同的提取剂：无水乙醚、丙酮、正己烷、丙酮-正己烷 1 ∶1（体积比）、丙酮-正己烷 2 ∶1（体积比）。35 ℃，200 r/min 恒温振荡提取2 h，过滤处理后485 nm波长处测量吸光度。

1.2.2.3 最佳提取时间设计

设置 5 个不同提取时间：1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，并以2 h 为空白对照提取时间。准确称取5 g 百香果浆液，对其进行最佳预处理；在6 组三角瓶中加入15 mL丙酮-正己烷2∶1（体积比）混合液。35 ℃，200 r/min 恒温振荡提取2 h，过滤处理后485 nm 波长处测量吸光度。

1.2.2.4 最佳液料比设计

以丙酮-正己烷2 ∶1（体积比）混合液为提取剂，设置 8 个不同的液料比：1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、6 ∶1、7 ∶1、8 ∶1（mL/g），以 15 mL 提取剂为空白对照添加量。准确称取5 g 百香果浆液，对其进行最佳预处理；取9组三角瓶，每组3 次重复，对其进行编号，放入处理好的提取液。35 ℃，200 r/min 恒温振荡提取2 h，过滤处理后485 nm 波长处测量吸光度。

1.2.2.5 最佳提取温度设计

设置 7 个不同的提取温度：20、25、30、35、40、45、50 ℃，以35 ℃为空白对照提取温度。准确称取5 g 百香果浆液，对其进行最佳预处理；取8 组三角瓶，每组3 次重复，对其进行编号，在三角瓶中放入处理好的提取液；在8 组三角瓶中加入提取剂，丙酮-正己烷2 ∶1（体积比）15 mL。200 r/min 恒温振荡提取2 h，过滤处理后485 nm 波长处测量吸光度。

1.2.3 正交试验设计

在单因素试验条件的基础上，根据番茄红素的提取情况作为参考因素，选取提取时间、提取温度和液料比这3 个因素，再选取这3 个试验因素中峰值附近的3 个水平对正交试验进行设置，进行正交试验分析，正交方案设计如表2 所示。

表2 正交试验因素及水平Table 2 Factors and level of orthogonal test

1.2.4 番茄红素标准曲线制作及含量的测定

由于番茄红素纯标准品性质极不稳定，且它的价格昂贵，而苏丹Ⅰ色素性质稳定且价格便宜，它的性质与番茄红素相近，故番茄红素标准曲线制作采用苏丹Ⅰ色素代替番茄红素标准品[20]；标准曲线的制作按照《GB/T 14215-2008 番茄酱罐头》[21]的要求进行制作，番茄红素最大吸收波长也采用上述标准的波长485 nm。番茄红素含量测定计算公式如下：

式中：X 表示试样中番茄红素的含量，mg/100 g；C表示试样色素提取液中番茄红素的浓度，μg/mL；M 表示试样质量，g。

1.3 数据分析

利用Excel 2007 软件对试验的数据进行整理和建库，SPSS 20.0 软件对正交试验数据进行方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析

2.1.1 预处理分析

新鲜的百香果中含水量较大，预处理中用无水乙醇浸泡是对百香果细胞进行脱水处理，使得番茄红素可以加快溶解于提取剂中；对百香果进行冷冻处理是让百香果细胞质基质中的水分冻结，形成晶体，从而破坏胞基质同时使得细胞壁破裂，让番茄红素能够加快析出。加入氯化钠，使得在细胞内外就形成了一个浓度差，从而促进细胞内的水分和一些无机盐以及胞内色素的析出，从而提高番茄红素的提取效果。对百香果进行离心处理，通过高速的离心来破坏细胞结构，使得细胞壁破裂，而番茄红素不溶于水，离心后处理后，番茄红素就基本集中于沉淀于底下的果肉中，在上清液的含量相对较少，故之后对其进行提取时倒去上清液，用沉淀于底下的百香果果肉进行提取。不对百香果进行任何处理，可以与其他预处理形成鲜明对比。不同的预处理对百香果中番茄红素提取的影响见图1。

图1 不同的预处理对百香果中番茄红素提取的影响Fig.1 Effect of different extraction pre-treatments on extraction efficiency lycopene from passion fruit

由图1 可知，用无水乙醇浸泡30 min，15 000 r/min离心处理与不用无水乙醇浸泡直接拿去离心处理的提取效果，优于用冷冻处理和氯化钠处理的效果，而不做任何处理的提取效果最差。用无水乙醇浸泡30 min，15 000 r/min 离心处理与不用无水乙醇浸泡直接拿去离心处理的效果差异不大，说明无水乙醇对百香果细胞的脱水效果并不显著；加入氯化钠的预处理效果优于放置于冰箱冷冻的效果。故综上所述，最优的预处理为15 000 r/min、离心15 min，接下去各试验的预处理均采取离心处理。

2.1.2 最佳提取剂分析

不同提取剂对番茄红素提取的影响见图2。

图2 不同提取剂对番茄红素提取的影响Fig.2 Effect of different extractant on extraction efficiency

由图2 可知，番茄红素在各个提取剂中的析出情况不一，也就造成了提取效果的差异，其中以丙酮-正己烷2 ∶1（体积比）混合提取剂的提取效果最佳，其次分别为丙酮-正己烷1 ∶1（体积比）、丙酮、无水乙醚等，正己烷的提取效果最差。非混合的提取剂提取效果较差，混合提取剂的提取效果较优，说明两种溶剂混合后，相互促进，大大提高了番茄红素的提取效果。而丙酮和正己烷混合液中，以2 ∶1（体积比）混合的效果优于 1 ∶1（体积比）的混合效果。

2.1.3 最佳提取时间分析

不同提取时间对番茄红素提取量的影响见图3。

图3 提取时间对番茄红素提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

如图3 所示，番茄红素的提取效果与提取时间呈现一个近似正态分布的图像，前期随时间进行递增，为正相关关系，达到最高峰后随时间进行递减，为负相关关系，峰值的时间为2.5 h，前期的提取量之所以会随时间递增，这是因为番茄红素是一种胞内色素，其主要存在于细胞的有色体中，番茄红素的析出需要一个缓慢的过程，从细胞中逐渐溶解到有机溶剂中，从而达到一种动态平衡。提取时间超过2.5 h 后，其提取量下降，这是由于番茄红素的不稳定性造成的，对光、对热的不稳定性，会造成番茄红素的降解，从而导致提取量减少。番茄红素对日光、紫外光等较为敏感，过长时间的日光暴晒和紫外光照射都会引起番茄红素的降解，故提取时间也不宜过长。因此番茄红素的最适提取时间为2.5 h。

2.1.4 最佳液料比分析

液料比对番茄红素提取的影响见图4。

图4 液料比对番茄红素提取的影响Fig.4 Effect of liquid to solid ratio on extraction efficiency

如图4 所示，番茄红素的提取效果与液料比呈现一个近似半边正态分布的图像，前期随液料比的递增进行递增，为正相关关系，达到最高峰后随液料比的递增进行递减，为负相关关系，峰值的液料比为3 ∶1（mL/g），后期随着液料比的增加，吸光度呈现下降趋势，说明液料比在3 ∶1（mL/g）的时候，提取液中的番茄红素基本析出，继续增加提取剂的量就相当于将番茄红素浓度稀释。因此，番茄红素的最佳液料比为3 ∶1（mL/g）。

2.1.5 最佳提取温度分析

番茄红素对热具有较为良好的稳定性，在付晶等[22]的研究中，较低的温度不会使番茄红素发生变性，它的热损失率较小，但是过高的温度会使得番茄红素发生异构化反应和氧化降解反应[23]，所以温度过高会对番茄红素的提取产生不利的影响。

图5 提取温度对番茄红素提取量的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

如图5 所示，番茄红素的提取效果与提取温度也呈现一个近似正态分布的图像，前期随提取温度的递增进行递增，为正相关关系，达到最高峰后随提取温度的递增进行递减，为负相关关系，峰值的提取温度为40 ℃，前期番茄红素的析出效果与提取时间之所以会呈现正相关关系，是因为温度的升高加快了分子的运动，随之促进了番茄红素分子的析出，同时有机溶剂对番茄红素的溶解能力也增加，其析出量也就变大了；温度超过40 ℃后它的提取量下降，这是因为较高的温度会使得番茄红素产生异构化和降解等其他的反应，从而造成了番茄红素提取量的下降；因此，本试验中番茄红素提取的最佳提取温度为40 ℃。

2.2 正交试验分析

由图3～图5 可知，在不同提取时间、提取温度和液料比处理下，番茄红素的提取效果均存在差异。故而在单因素试验的基础上，根据正交试验设计原理，选取提取时间A、提取温度B 和液料比C 作为3 个因素，试验方案及结果见表3 和表4。

表3 正交试验极差分析Table 3 The range analysis of orthogonal experiment

表4 正交试验方差分析Table 4 Analysis of orthogonal test difference

表3 为正交试验极差分析，液料比对提取效果的影响最大，温度次之，时间最小，不过二者R 的数值差异不大，故对番茄红素提取效果影响相差不是很大。从表中可以看出，根据吸光度的大小从而来判断番茄红素的析出效果，其中，吸光度最高的处理是试验号为7 的处理，其处理条件为A3B1C2，以此认定番茄红素最佳的提取处理为：提取时间3 h，提取温度35 ℃，液料比 3 ∶1（mL/g）。

表4 是对正交试验进行显著性分析，根据表格中的F、P 可知，液料比对番茄红素的提取具有显著影响，提取时间和提取温度的F 值相差不大，故二者对提取效果影响相近且不具显著影响。从以上两个表格可知，正交试验的极差分析和显著性分析结果相对一致，都是液料比为主要影响因素，提取时间和提取温度为次要影响因素且影响效果相近。

2.3 验证试验

对正交试验所确定的最佳提取条件进行验证分析，以单因素试验的最佳提取条件作为对照，试验重复3 次，结果见表5。

表5 正交试验验证Table 5 Verification of orthogonal experiments

从表5 可知，正交试验的吸光度高于单因素试验的吸光度，即正交试验番茄红素的提取量大于单因素试验，故正交试验的提取条件优于单因素试验的提取条件，所以，本试验中百香果种番茄红素最佳的提取工艺为：提取时间3 h、提取温度35 ℃、液料比 3 ∶1（mL/g）。

2.4 标准曲线的建立及含量的计算

根据GB/T 14215-2008《番茄酱罐头》中的方法制作标准液，所得数据用Excel 2007 进行处理，得出番茄红素标准曲线，为：y=0.221 5x-0.005 1，R2=0.999 3。曲线如图6 所示。

图6 番茄红素标准曲线图Fig.6 Standard curve of lycopene

准确称取5 g 百香果磨碎的果肉，按照最佳提取工艺进行处理，根据标准曲线及计算公式计算番茄红素的含量，结果为百香果中番茄红素的提取量为3.54 mg/100 g。

3 结论

试验结果表明：将百香果的研磨液放置于15000r/min的高速离心机中离心15 min 为最佳的预处理方法；用丙酮-正己烷2 ∶1（体积比）混合液作为提取剂时提取对番茄红素的溶解效果较好，其中液料比为主要影响因素，提取时间和提取温度为次要影响因素且影响效果相近。本试验番茄红素的最佳提取工艺为：提取时间 3 h、提取温度 35 ℃、液料比 3 ∶1（mL/g）。

本试验对提取剂的选择是参照李丽杰等[24]的研究进行设置的，可能还存在其他提取剂对番茄红素的溶解效果更好的情况；在提取条件上，再进行更进一步的优化时，可以考虑改变提取剂的pH，来得到更优化的提取条件，因为在碱性条件下，番茄红素更容易被破坏掉。

番茄红素从被发现至今，也算是经历了一个较为漫长的过程，从最初的不被重视，到越来越多的生理功能被发觉出来，番茄红素越发得到人们的青睐。随着时代的发展，人们对生活质量的要求越加提高，尤其在食品安全方面更为关注，在各种不合格的食品添加剂事件层出不穷时，番茄红素作为一种天然的功能性色素，对人体存在诸多好处，在食品添加剂方面存在着天然的优势。可能随着对番茄红素研究的深入，更多的功能会被发掘出来，大规模工业化生产方面的工艺可能会日益完善，番茄红素将可能被应用到更加广阔的领域中。