麦冬多糖对脂多糖诱导巨噬细胞损伤的保护作用及机制研究*

周梦玲，袁厚宇，吴素玲

1 南京中医药大学，南京 210029；2 南京中医药大学附属南京中医院，南京210001；3 南京市第一医院，南京 210006

干燥综合征（sjo¨gren's syndrome，SS）是一种以唾液腺和泪腺炎性细胞浸润及破坏为特征的慢性炎症性疾病，可以发展为严重的口干症（口干）和干燥性角膜结膜炎（干眼症），并可累及多种组织和器官[1]。病原微生物感染导致的慢性炎症反应在SS 的发生发展中起着重要作用[2]。巨噬细胞作为天然免疫系统重要组成部分，能够通过杀灭病原体并分泌相关介质、参与免疫调节、干预炎症进程，但其损伤导致的过度激活又是介导炎症反应和组织损伤的重要因素[3]。有文献报道，激活的巨噬细胞能够渗入角膜基质、角膜缘和泪腺等靶器官中，促进炎症和组织病变[4]，使泪腺分泌减少，促进干眼症的形成[5]；巨噬细胞在唾液腺的浸润以及释放相关炎性因子，不仅加速腺体损伤，而且增加罹患淋巴瘤的风险[6]。有文献证实，巨噬细胞衍生的几丁质酶在损伤干燥综合征患者的外分泌腺体的过程中起着重要作用，故巨噬细胞功能障碍可能是导致干燥综合征炎症反应的重要原因[7]。因此，维持巨噬细胞的稳态是减轻炎症的有效手段。

麦冬是具有免疫调节作用的中草药，对机体免疫起着双向调节作用。麦冬多糖是麦冬重要的组分，现代研究表明，麦冬多糖具有降低血糖、血脂，抗肿瘤、消炎等作用[8]。有文献报道，麦冬多糖能够调节水通道蛋白5、血管活性肠肽和降低炎性因子的分泌，对颌下腺起到很好地保护作用[9]。

本文采用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7 细胞、构建巨噬细胞损伤模型，探究麦冬多糖对巨噬细胞的保护作用，并初步探索其可能机制，为干燥综合征药物的研发提供新的思路。

1 实验材料

1.1 主要仪器

微量分析天平（瑞士梅特勒IKA T10）；Bio-Tek多功能酶标仪（Bio-Tek Epoch）；荧光显微镜（奥林巴斯BX43）；全自动化学发光凝胶成像分析系统（Bio-Rad Chemi Doc XRS+）；垂直电泳系统（Bio-Rad Mini Protean Terta）；转膜印迹系统（Bio Mini Trans-Blot）；低温冰箱（海尔DW-25L262）；台式离心机（美国贝尔曼）。

1.2 药品与试剂

DMEN 培养基、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、10%胎牛血清（苏州赛默飞世尔仪器有限公司）；100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素（Beyotime 公司）；脂多糖（LPS，批 号#068M4053V，Sigma 公司）；CCK-8（批号K1018，ApexBio Tech LLC 公司）；麦冬多糖（批号9070-92-3，天津万象恒源科技公司）；IL-Iβ、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒（批号SV1UTPAHR9、ZD2B9RH4JH、DJEI8XA78V，南京纳晟生物科技限公司）；MDA、SOD 试剂盒（批号20190327，南京建成生物工程研究所）；GAPDH（批号#5174）、TLR4（批号#14358）、MyD88（批号#4283）、IκBα（批号#4814）、p-IκBα（批 号#2859）、p65（批 号#8242）、p-p65（批 号#3033），以上抗体均购于Cell Signaling Technology公司；75%、95%乙醇、纯净水均自制。

1.3 细胞株

RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞），购于上海酶研科技有限公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养

RAW264.7 细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃、5%CO2培养，每24～48 h 换液一次，取对数生长期细胞进行后续实验。

2.2 CCK-8 筛选LPS、麦冬多糖的浓度

收集对数生长期细胞，以5×104/mL 个接种至96 孔细胞培养板，每孔加入100 μL 细胞悬液，置于5%CO2、37 ℃培养箱，培养24 h，依次加入不同浓度的LPS（每孔0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg·mL-1），每个浓度设3 个复孔，培养6 h，每孔内加入CCK-8 溶液10 μL，培养2 h，用酶标仪测定各孔在450 nm 处的OD 值。筛选麦冬多糖浓度方法大致同前，设置不同浓度（每孔0、5、10、50、100、500、1000 μg·mL-1），每个浓度设4 个复孔，置于5%CO2、37 ℃培养箱，培养24 h，依次加入不同浓度的含药培养基100 μL，培养24 h，在每个孔内加入CCK-8 溶液20 μL，培养2 h，用酶标仪测定各孔在450 nm 处的OD 值。

2.3 CCK-8 法检测麦冬多糖对LPS 诱导的细胞损伤的预保护

收集对数生长期细胞，以5×104/mL 个接种至96孔细胞培养板，每孔加入100 μL 细胞悬液，置于5%CO2、37 ℃培养箱，培养24 h，分为对照组、模型组及麦冬多糖低、中、高剂量组（50、100、500 μg·mL-1），对照组、模型组各加入空白培养基100 μL，麦冬多糖低、中、高剂量组依次加入相应浓度的含药培养基100 μL，每个浓度设4 个复孔，培养24 h；除对照组外，余各组每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培养6 h，在每个孔内加入CCK-8 溶液20 μL，培养2 h，用酶标仪测定各孔在450 nm 处的OD 值。

2.4 ELISA 试剂盒检测上清液中的炎性因子含量

将对数生长期细胞以5×104/mL 个接种至6 孔细胞培养板，每孔2 mL，于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，细胞贴壁约80%后，分别设置对照组、模型组、麦冬多糖低、中、高剂量组（50、100、500 μg·mL-1），培养24 h；除对照组外，余各组每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培养6 h，收集各组细胞上清液，严格按照ELISA 试剂盒操作说明检测上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

2.5 上清液中MDA 含量和SOD 活力检测

将对数生长期细胞以5×104/mL 个接种至6 孔细胞培养板，每孔2 mL，于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，细胞贴壁约80%后，分别设置对照组、模型组、麦冬多糖低、中、高剂量组（50、100、500 μg·mL-1），培养24 h；除对照组外，余各组每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培养6 h，收集各组细胞上清液，严格按照MDA 和SOD 试剂盒操作说明检测上清液中SOD 活力和MDA 含量。

2.6 Western blot 技术分析蛋白的表达

将对数生长期细胞以5×104/mL 个接种至6 孔细胞培养板，每孔2 mL，于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，细胞贴壁约80%后，分别设置对照组、模型组、麦冬多糖低、中、高剂量组（50、100、500 μg·mL-1），培养24 h；除对照组外，余各组每孔加入LPS 8 μg·mL-1，培养6 h，收集细胞于RIPA 裂解液中提取总蛋白，BCA 法测定蛋白含量。蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳并转移至PVDF 膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别与TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、GAPDH 抗体孵育，TBST 漂洗5次，每次5 min 后再与辣根过氧化物酶偶联的抗体反应，膜经TBST 漂洗10 次，每次5 min 后再用增强化学发光法（ECL）作发光试剂显影，灰度成像软件测定主带的光密度值，计算上述蛋白在各组细胞中的表达水平。

2.7 统计学分析

采用GraphPad Prism7.0 统计软件进行数据的分析处理，数据以均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析和t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义；P＜0.01 为差异显著。

3 结果

3.1 LPS 对巨噬细胞活力的影响

采 用LPS 不同浓度（0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg·mL-1）处理细胞6 h 后，结果显示，当LPS 浓度达到8 μg·mL-1时，细胞活力显著降低（P＜0.01），因此本实验采用8 μg·mL-1作为造模浓度。见图1。

3.2 麦冬多糖对巨噬细胞活力的影响

实验结果显示，与对照组相比，随着麦冬多糖浓度升高，巨噬细胞活力均无明显变化，故选取50、100、500 μg·mL-1为麦冬多糖低、中、高3 个剂量。见图2。

图2 麦冬多糖对巨噬细胞活力的影响（n=4）

3.3 麦冬多糖对LPS 诱导巨噬细胞损伤的保护作用

实验结果显示，与对照组相比，给予浓度为8μg·mL-1的LPS 刺激后，巨噬细胞活力显著降低（P＜0.01）；采用不同浓度的麦冬多糖预处理24 h 后，细胞活力均有不同程度上升（P＜0.01）。见图3。

图3 麦冬多糖对LPS 诱导巨噬细胞损伤的保护作用（n=4）

3.4 麦冬多糖对上清液中炎性因子的影响

实验结果显示，与对照组相比，模型组中TNFα、IL-6、IL-1β 含量均显著升高（P＜0.01）。采用不同浓度的麦冬多糖预处理24 h 后，与模型组相比，麦冬多糖低、中、高剂量组中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量显著下降（P＜0.05）。见图4。

图4 麦冬多糖对上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量的影响（n=6）

3.5 麦冬多糖对上清液中SOD 和MDA 的影响

实验结果显示，与对照组相比，模型组上清液中的SOD 活力显著降低，MDA 含量显著升高（P＜0.01）；采用不同浓度的麦冬多糖预处理24 h 后，与模型组相比，麦冬多糖低、中、高剂量组中SOD 活力升高（P＜0.05），MDA 含量显著降低（P＜0.01）。见图5。

图5 麦冬多糖对血清SOD 和MDA 的影响（n=6）

3.6 麦冬多糖对TLR4/MyD88/NF-κB 通路相关蛋白的影响

实验结果显示，与对照组相比，模型组中TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白的表达水平显著升高，p-IκBα/IκBα 和p-p65/p65 的比值显著升高，IκBα蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，麦冬多糖低、中、高剂量组中TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白的表达水平均显著降低，p-IκBα/IκBα和p-p65/p65 比值显著降低，IκBα 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），p65 蛋白水平无明显差异。见图6。

4 讨论

图6 麦冬多糖对TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路相关蛋白的影响（n=6）

炎症是免疫系统对感染和损伤的有害刺激的生理反应，其通过清除感染和有害因子以便维持组织内环境的稳定性。巨噬细胞作为机体免疫系统的第一道防线，不仅能够通过不同的模式识别受体吞噬细菌、异物、坏死细胞和碎片，还能起到抗原呈递作用，激活机体适应性免疫，从而起到防御、组织修复和免疫调节的作用[10]。少量的巨噬细胞死亡有利于巨噬细胞更新炎症的进程，但大量的巨噬细胞死亡可以导致大量炎性因子及炎性介质的释放，诱导细胞继发性坏死，从而加重炎症反应与组织损伤[11]。因此抑制巨噬细胞的过度活化，防止其损伤对炎症的缓解尤为重要。

本实验通过构建LPS 诱导的巨噬细胞损伤模型，观察麦冬多糖对巨噬细胞的保护作用，结果显示，LPS 浓度在8μg·mL-1时，巨噬细胞活力出现明显下降，采用麦冬多糖低、中、高剂量（50、100、500 μg·mL-1）预处理后，均可提高巨噬细胞活力，且麦冬多糖能够降低IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平而不影响细胞活力。上述结果表明，麦冬多糖能够提高巨噬细胞活力，减轻巨噬细胞损伤，抑制其活化，减少巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α 的分泌。

巨噬细胞活化后能通过合成活性氧（ROS）和活性氮（RNS）而杀灭微生物[12]，但过度的活性氧和活性氮的产生会干扰细胞的代谢和调节，造成细胞损伤，引发IL-6、TNF-α 等炎性因子的释放[13]。超氧化物歧化酶（SOD）能参与活性氧的代谢，降低氧化应激反应，其能够间接反映细胞的抗氧化能力[14]，ROS能够诱导细胞中多不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物丙二醇（MDA），其能够间接反映ROS 造成的氧化损伤程度[15]。

本研究发现，LPS 诱导后上清液中巨噬细胞SOD 活力降低，MDA 含量升高，采用麦冬多糖预处理后，SOD 活力升高，MDA 含量降低，说明其可以增强巨噬细胞的抗氧化能力，同时降低巨噬细胞中ROS 的分泌，减轻巨噬细胞氧化应激反应。

NF-κB 是一种转录因子，在静息状态时，其与抑制因子IκBα 组成p65-p50-IκBα 三聚体形式，存在于细胞浆中。Toll 样受体4（TLR4）能够在巨噬细胞中表达，其与相应配体结合后，能够激活接头蛋白转导子MyD88，通过级联信号的传导，诱导IκBα磷酸化，导致IκBα 的泛素化和降解，并磷酸化激活NF-κB/Rel 复合物，其进而易位至细胞核，诱导靶基因表达，增加ROS、RNS 和促炎细胞因子的产生，加重炎症反应[16]。

为阐明麦冬多糖对巨噬细胞的保护机制，本研究检测了麦冬多糖对TLR4/MyD88/NF-κB 的影响，结果显示，与对照组相比，模型组中TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白表达显著升高，IκBα 蛋白表达显著下降；采用麦冬多糖预处理后，能升高IκBα 蛋白表达，降低TLR4、MyD88、p-IκBα、p-p65 蛋白的表达。诸此表明，麦冬多糖能够通过抑制TLR4、MyD88 蛋白的表达，并通过抑制IκBα 的磷酸化，阻滞IκBα 的降解，抑制p65 的磷酸化，从而抑制TLR4/MyD88/NF-κB 相关信号通路的激活，减少炎性因子、ROS、RNS 的产生，从而起到保护巨噬细胞的作用。

综上所述，麦冬多糖对LPS 诱导的巨噬细胞损伤有很好地保护作用，其可能是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB 相关信号通路，减少氧化应激损伤和巨噬细胞炎性因子的分泌，但其深层机制仍需进一步探讨。