UPLC 法测定决明子中4 种蒽醌类成分的含量*

朱 琳，张志同，陈 隽，庄晓庆，马春燕，龚旭东

南通市食品药品监督检验中心，南通 226006

决明子是常用中药材，也是家喻户晓的中药保健食品。《中国药典》2015 年版一部规定来源为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子[1]。具有清热明目、润肠通便的功效。用于治疗目赤涩痛、羞明多泪、头痛眩晕、目暗不明、大便秘结等症候。

决明子主要含有蒽醌、萘并吡咯酮、脂肪酸、氨基酸、无机元素等化学成分，其中蒽醌类化合物约占1%[2]。《中国药典》2015 年版一部采用甲醇回流提取，取滤液蒸干后用稀盐酸加热水解，再用三氯甲烷萃取后测定大黄酚及橙黄决明素的含量；其制备方法繁琐、耗时较长，且使用大量对人体及环境有害的三氯甲烷。本实验在文献研究的基础上，通过单因素试验优化蒽醌类化合物含量测定中供试液的制备方法，建立决明子中蒽醌类化合物的UPLC 含量测定方法，此为决明子含量测定的改进，为同道提供参考。

1 仪器与材料

橙黄决明素对照品（批号111900-201605，纯度98.3%），大黄素对照品（批号110756-201512，纯度98.7%），大黄酚对照品（批号110796-201621，纯度99.2%），大黄素甲醚（批号110758-201415，纯度99.1%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

决明子药材主要收购于各药材市场和产地，经南通市食品药品监督检验中心龚旭东主任中药师鉴定确认，样品信息见表1。样品均粉碎后过50 目筛，置干燥器中备用。

表1 决明子样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

Waters Acquity UPLC BEHC18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0 min 60%B，7 min 10%B，10 min 10% B，11 min 60% B，15 min 60% B；检测波长为284 nm；柱温为30 ℃；流速为0.2 mL·min-1；进样量为2 μL。

橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的理论塔板数分别为9.0×104、2.0×105、2.8×105、3.0×105。色谱图见图1。

图1 （A）供试品溶液和（B）对照品溶液UPLC 图谱

2.2 对照品溶液制备

采用三维有限元方法分析拔桩受力，桩体单元如图2所示，桩体横断面如图3所示。考虑桩土间摩擦力是沿程分布的，如果不考虑地下水的作用，则桩体上拔时最大拉应力为3.5 MPa。上拔时最佳着力点应避开桩头，在距离桩顶约1 m处均匀向上施力，管桩可以被拔出。

精密称取橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解制成浓度分别为194.5、49.9、299.0、61.0 μg·mL-1的混合对照品贮备液。取贮备液，逐级稀释为6 个不同浓度的对照品溶液，进样。橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的回归方程见表2。

表2 回归方程、浓度范围、检测限（LOD）和定量限（LOQ）

2.3 供试品溶液制备

取决明子粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（10∶1）的混合溶液50 mL，称定重量，置80 ℃水浴中加热回流1 h（若瓶壁有黏附物，须超声溶解），再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。同时取决明子粉末，按《中国药典》2015 年版四部水分测定法第二法（烘干法）进行水分测定。以下计算结果均按干燥品计。

2.4 供试品溶液制备方法考察

2.4.1 甲醇与盐酸配比考察 取同一批决明子粉末（样品编号S1）0.5 g，共5 份，分别加入甲醇-盐酸（10∶0.25）、甲醇-盐酸（10∶0.5）、甲醇-盐酸（10∶1）、甲醇-盐酸（10∶2）、甲醇-盐酸（10∶3）配比的混合溶液50 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表3。

表3 甲醇与盐酸配比下提取的各成分含量

甲醇-盐酸（10∶1）时，达到水解完全，故选择该配比的混合溶液。

2.4.2 供试品取样量考察 取同一批决明子粉末（样品编号S1）0.4、0.5、0.6、0.8 g 共4 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表4。

表4 不同供试品取样量下测得各成分含量

取样量为0.5 g 时，提取效率最高，故选择供试品取样量为0.5 g。

2.4.3 水解温度考察 取同一批决明子粉末（样品编号S1）0.5 g，共3 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在70 ℃、80 ℃、90 ℃水解1 h，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表5。

表5 不同水解温度提取出各成分的含量

水浴温度80 ℃时，达到水解完全，故选择该水解温度。

2.4.4 水解时间考察 取同一批决明子粉末（样品编号S1）0.5 g，共3 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别水解0.5、1、1.5 h，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表6。表明1 h 即可完全水解。

2.5 色谱条件优化及方法学考察

2.5.1 柱温 分别设置为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，其他条件同“2.1”项，结果表明，30 ℃时主要色谱峰分离度及响应值最佳。

表6 不同水解时间提取各成分的含量

2.5.2 流速分别选择流速0.15、0.20、0.25 mL·min-1，其他条件同“2.1”项，结果表明，流速0.20 mL·min-1时，主要色谱峰分离度较佳。

2.5.3 精密度试验 取同一批供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，结果表明，橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD 分别为0.8%、0.9%、0.8%、0.8%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件测定，结果表明，橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD 分别为1.1%、1.9%、1.2%、1.9%，表明供试品溶液在24 h 内基本稳定。

2.5.5 重复性试验 取同一批决明子粉末（样品编号S1）约0.25 g，共6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果表明，橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD 分别为1.2%、1.8%、1.3%、1.9%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收试验 取同一批决明子粉末（样品编号S1）约0.25 g，共9 份，分别按已知含量的80%、100%、120% 3 个水平精密加入、由对照品贮备液稀释而来的混合对照品溶液25 mL，再加入甲醇-盐酸（10∶2）的混合溶液25 mL，其余按“2.3”项下方法制备供试品溶液，计算回收率，结果见表7。

表7 加样回收率试验结果（n=9）

2.6 样品测定

采用《中国药典》2015 年版一部决明子“含量测定”项下供试品溶液制备方法及本文“2.3”项下供试品溶液制备方法，分别制备之，按“2.1”项下色谱条件测定，并作比较。根据相应线性关系计算样品中各组分的含量（按干燥品计），结果见表8。

3 讨论

3.1 本文采用UPLC 法建立了决明子中4 种蒽醌类成分的含量测定方法，在样品制备与色谱方法方面较《中国药典》2015 年版中决明子蒽醌类成分含量测定方法有所改进，具有简便、快速与准确的优点。分析方法的提升得益于分析仪器与色谱柱性能的进步。实验所用样品溶液可以采用较强酸度的甲醇-盐酸（10∶1）混合溶液，一般的色谱柱是不耐受的，而Waters Acquity UPLC BEH C18（150mm×2.1mm，1.7 μm）色谱柱的pH 范围为1～12，可以耐受pH 1的强酸，故改进药典方法有了基础。

3.2 在“2.1”项色谱条件下，供试品溶液色谱中，在与橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品溶液色谱相应的位置上均检出色谱峰，且紫外光谱图与对照品均一致。初期查阅文献[3-5]时，有较多文献表明，在决明子中检出大黄酸及芦荟大黄素，而在本次试验中，在大黄酸对照品相应的保留时间，供试品中未出现色谱峰，而在芦荟大黄素对照品相应的保留时间检出色谱峰，但紫外光谱图与芦荟大黄素不一致，与橙黄决明素紫外光谱图较为相似，怀疑与橙黄决明素有相似的结构，其确切结构有待进一步研究。

表8 21 批决明子中不同提取方法所得的各组分含量（%）

3.3 由表8 可知，在21 批样品中，采用本方法测定的橙黄决明素含量明显高于《中国药典》2015 年版一部所测含量结果，大黄酚、大黄素、大黄素甲醚含量均不低于《中国药典》方法所测结果。

本方法直接采用甲醇-盐酸（10∶1）的混合溶液加热水解、提取决明子中蒽醌类组分，简化了提取步骤，避免了有毒试剂三氯甲烷的使用，且提高了提取效率，操作简单，重复性好。

3.4 采用了UPLC 法快速检测决明子中4 种组分的含量，大大节省了分析时间，节约了试剂，且本方法灵敏度、准确度、塔板数等均优于HPLC 法。

3.5 按《中国药典》提取方法的21 批样品中，S15号橙黄决明素含量低于药典中的标准限度，S2、S3、S4、S9、S13、S15、C2、C3、C4 的大黄酚含量低于药典中的标准限度，不合格率达43%，结果与市场普遍反映的决明子含量测定不合格的现状相符，具体原因有待深入研究。