成骨细胞吞噬内化金黄色葡萄球菌在骨髓炎发病机制中的作用*

蔡渊卿 方心俞 张翀景 张超凡 黄子达 李文波 杨滨 张文明**

（福建医科大学附属第一医院1.骨科，2.检验科，福州 350005）

骨髓炎是一种可造成严重骨感染与骨破坏的疾患，可见于糖尿病足、骨折内固定术后及关节置换术后[1-3]。目前骨髓炎治疗方法主要为彻底清创、开窗引流并早期联合使用抗生素，含抗生素骨水泥珠及包括分时控释纳米纤维支架等在内的新一代仿生材料亦用于骨髓炎的治疗[1,4]。尽管如此，骨髓炎的治疗依然不尽人意，存在对抗生素耐药、反复复发等特点。

骨髓炎可由多种细菌感染引起，金黄色葡萄球菌为最常见病原菌，可分泌α、β等溶血毒素，从而造成局部骨组织的缺血、坏死。既往认为金黄色葡萄球菌为一种胞外寄生菌，不会侵入宿主细胞，而越来越多的研究表明，金黄色葡萄球菌可侵入成骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞及上皮细胞等非专职性吞噬细胞（nonprofessional phagocytic cells,NPPCs）中，并被NPPCs 内化。金黄色葡萄球菌也通过此机制得以逃避宿主免疫系统和抗生素的杀灭，在成骨细胞内复制、发生表型转换，并在细胞死亡后被重新释放，感染其他成骨细胞，从而导致慢性骨髓炎迁延不愈。因此，对这一过程进行充分的认识和研究有助于提高对慢性骨髓炎发病机制的了解及开发新的治疗靶点。

成骨细胞吞噬金黄色葡萄球菌大致可分为3 个过程：①吞噬内化：金黄色葡萄球菌通过其表面的识别黏附基质分子的微生物表面组分(microbial surface components recogniazing adhensive matrix molecules,MSCRAMM)与成骨细胞外基质（extracellular matrix,ECM）或细胞上的受体结合，被成骨细胞吞噬并内化；②胞内持留：内化后一部分细菌被杀灭，而另一部分细菌通过逃离吞噬溶酶体，发生表型转换[如小菌落变异（small colony variant,SCV）]等机制持留于成骨细胞内；③细胞因子的分泌与凋亡：金黄色葡萄球菌或其成分（如脂蛋白）与细胞外和/或细胞内受体结合，促进炎症因子、趋化因子或抗菌肽（antibacterial peptides,AMPs）的产生，从而募集免疫细胞发挥免疫杀灭作用，并导致成骨细胞的凋亡及破骨细胞数量的增多，骨代谢失平衡，导致骨量的丢失。

1 吞噬内化

病原微生物主要通过2 种方式粘附宿主细胞:①直接粘附于宿主细胞表面受体，如李斯特菌、鼠疫耶尔森菌、淋球菌；②通过细胞外基质蛋白间接地与宿主受体结合，金黄色葡萄球菌正是通过此机制粘附于成骨细胞[5,6]。金黄色葡萄球菌被吞噬内化过程需细菌和宿主细胞多种因子相互作用完成。

1.1 金黄色葡萄球菌MSCRAMM

金黄色葡萄球菌表面有多种MSCRAMM，如纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding proteins,FnBPs)、纤维蛋白原结合蛋白、细胞外黏附蛋白(extracelluar adherence protein,Eap)等。FnBPs是介导金黄色葡萄球菌侵袭成骨细胞的主要蛋白。金黄色葡萄球菌中存在2种FnBPs，分别由FnbA和FnbB编码，这两种基因存在于大多数有侵袭性的菌株中。纤连蛋白（fibronectin,Fn）是细胞外基质中重要的二聚体糖蛋白，是连接金黄色葡萄球菌与成骨细胞之间的桥梁，一方面，金黄色葡萄球菌表面的FnBP 可与Fn 结合，另一方面，通过α5β1 Fn可与成骨细胞整合素结合。FnBPs与Fn结合后，Fn的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginyl-glycyl-aspartic,RGD）模体可被其受体如整合素胞外区域等识别，而当整合素被激活后，除了触发一系列的信号通路外，还可重塑肌动蛋白，从而在细菌附着处附近募集辅肌动蛋白、桩蛋白、斑联蛋白、张力蛋白、粘着斑激酶和肉瘤酪氨酸（sarcoma tyrosine,Src）激酶形成一种局部黏附素样蛋白复合物，介导了金黄色葡萄球菌的粘附及内化[7,8]。Ahmed 等[9]将由FnBP结合域组成的可溶性重组蛋白片段与金黄色葡萄球菌Cowan 和P1 株进行预孵育，则完全消除了金黄色葡萄球菌的侵袭能力，其原因可能为与宿主细胞受体相竞争结合金黄色葡萄球菌FnBP。因此“Fn桥梁”在金黄色葡萄球菌粘附及内化中扮演重要角色。

虽然FnBP 与Fn 结合为金黄色葡萄球菌最常见侵袭机制，但敲除FnBP 并不能完全消除金黄色葡萄球菌的内化，提示可能还存在其他黏附机制。Testoni等[10]研究表明金黄色葡萄球菌胶原蛋白结合蛋白（collagen adhesin,Cna）、骨唾液酸蛋白结合蛋白（bone sialoprotein binding protein,Bbp）亦参与到这一过程中。而其他MSCRAMM 也可通过与细胞外基质中蛋白结合，介导金黄色葡萄球菌的粘附与内化。

金黄色葡萄球菌通过细胞外基质蛋白间接地与成骨细胞模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)结合，是侵入成骨细胞并引起骨髓炎的第一步。因此，开发抑制金黄色葡萄球菌与成骨细胞表面PRRs 结合并内化的靶向药物将有效预防骨髓炎的发生。

1.2 成骨细胞通过PRRs识别金黄色葡萄球菌

Toll 样受体（toll-like receptors,TLR）是PRRs 中的一员，可以识别细胞膜表面的多种病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，在先天性免疫中发挥重要作用。迄今为止，已经在哺乳动物体内发现了TLR 的13 个成员，它们识别不同的PAMPs并介导了体内特定的信号通路。细菌源性的PAMPs 主要通过TLR-2、TLR-4、TLR-5 及TLR-9 识别并结合，其中TLR-4 与TLR-2 主要识别细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和肽聚糖，而TLR-5和TLR-9则分别识别细菌的鞭毛抗原和DNA中未发生甲基化的CpG序列。

Kikuchi 等[11]研究报道了在小鼠成骨细胞中存在TLR-2 及TLR-4 的编码基因。Gasper 等[12]发现添加抗体阻断TLR-4后，LPS诱导成骨细胞分泌的CXC趋化因子配体10（chemokine ligand 10,CXCL10）大大降低，从而验证了TLR-4 在成骨细胞中的功能表达。尽管在成骨细胞存在TLR-2 的编码基因，但与其特异性配体（如细菌的肽聚糖）结合后，并不能激活成骨细胞[12,13]，提示在成骨细胞中不表达功能性TLR-2，或者TLR-2 并未参与成骨细胞的免疫反应中，而参与骨髓炎的骨代谢平衡调节中。Mohamed 等[14]亦报道了TLR-9 与寡核苷酸结合后，可以激活一些转录因子的表达，如NF-κB，使成骨细胞产生大量促炎症因子，从而促进成骨细胞的凋亡和破骨细胞的生成。Madrazo等[15]通过蛋白免疫印迹发现在成骨细胞中存在TLR-5的功能性表达。当成骨细胞暴露于鞭毛抗原时，可观察到TLR-5的表达上调，从而激活转录因子JNK1/2且产生大量IL-6。总之，TLRs 是成骨细胞感知金黄色葡萄球菌的一种机制。

除了TLR 之外，在细胞内还存在另一种PRRs——NOD 样受体（nod-like receptors,NLRs），包括NOD1、NOD2、NOD 样受体家族3（NOD-like receptor family pyrin domain containing protein 3,NLRP3）等。部分金黄色葡萄球菌在内化之后会被释放至细胞质中，进而被NLRs 识别。Marriott 等[16]用金黄色葡萄球菌感染成骨细胞后，可发现成骨细胞中NOD1与NOD2表达上调，并通过启动胞内的信号通路产生大量的免疫因子。且Chauhan 等[17]发现，NOD2 在成骨细胞中可发挥不同的作用，一方面NOD2可促进成骨细胞对胞内菌产生免疫反应，另一方面，NOD2 可调节成骨细胞根据入侵细菌种类的不同而产生不同的反应。

Claro等[18,19]发现成骨细胞除了通过依赖PRRs识别PAMPs外，还可通过非PRRs依赖性方式与金黄色葡萄球菌发生相互作用。他们研究发现，成骨细胞的肿瘤坏死因子受体-1（tumor necrosis factor receptor,TNFR-1）可直接与金黄色葡萄球菌的A 蛋白结合，从而促进细胞因子的产生和启动免疫反应，最终导致成骨细胞的程序性死亡，引起骨代谢失平衡。

金黄色葡萄球菌的侵入若能被成骨细胞特异性的PRRs 识别并导致成骨细胞的凋亡，则金黄色葡萄球菌将被重新释放出胞外，并被中性粒细胞等免疫细胞杀灭。因此开发诱导已经侵入金黄色葡萄球菌的成骨细胞发生凋亡的靶向药物将在早期有效控制骨髓炎。

2 胞内持留

金黄色葡萄球菌MSCRAMM 与细胞外基质蛋白结合后，通过α5β1 整合素、actin 蛋白等发生内化。金黄色葡萄球菌内化后，其毒力因子有助于金黄色葡萄球菌逃离溶酶体的酸性环境，避免被宿主细胞杀灭，此外，其毒力因子亦参与SCV 表型的转换，从而使其适应胞内环境并加强对抗生素的耐药。

2.1 金黄色葡萄球菌逃离溶酶体

Jauregui等[20]利用激光共聚焦发现在感染2 h后，金黄色葡萄球菌位于成骨细胞的溶酶体中，最近Moldovan 等[21]研究亦证明了这一点，并发现了金黄色葡萄球菌还可逃离溶酶体。Hamza 等[22]比较了巨噬细胞与成骨细胞在感染金黄色葡萄球菌后不同的细胞反应。作为一种典型的专职吞噬细胞，巨噬细胞吞噬内化的金黄色葡萄球菌数量远多于成骨细胞，然而在感染后的1～6 d，成骨细胞中存活的金黄色葡萄球菌比例却高于巨噬细胞。分析其机制为在成骨细胞中，金黄色葡萄球菌逃离了溶酶体，被释放至细胞质中，避免了酸性水解酶的作用。Vandenesch等[23]研究发现，金黄色葡萄球菌的这一逃离过程需要多种毒力因子的参与，特别是膜损伤因子，包括溶血素和酚可溶性调节肽(phenol-soluble modulins,PSM)等。其中PSM 发挥重要作用，Vandenesch 等[23]研究支持PSM 参与金黄色葡萄球菌从成骨细胞囊泡中逃逸至胞质这一过程，Rasigade等[24]也证明了这一点。

总之，成骨细胞作为一种NPPCs，其胞内缺乏完全清除金黄色葡萄球菌的机制，金黄色葡萄球菌通过其自身膜损伤因子等得以逃离溶酶体，在细胞内长期存活并复制。因为逃离吞噬溶酶体，金黄色葡萄球菌将得以在成骨细胞中长期持留，并且成骨细胞为其提供了“庇护所”，使其逃避了抗生素及宿主免疫系统的杀灭，因而导致慢性骨髓炎或骨髓炎迁延不愈。因此，进一步研究如何增强成骨细胞吞噬溶酶体对胞内持留金黄色葡萄球菌的清除能力对于慢性骨髓炎的治疗有重要意义。

2.2 金黄色葡萄球菌发生SCV表型转变

金黄色葡萄球菌侵袭成骨细胞后，除了逃逸溶酶体外，还可在细胞质产生SCV。SCV是正常菌群在环境压力下如抗生素压力、氧压力及酸压力等诱导产生的，通常只占正常群体的一小部分。SCV有生长缓慢、对抗生素耐药和表型多样的特点，因此SCV通常与持续性感染或复发性感染有关[25]，由于其生长缓慢易被临床忽略，且易形成生物膜，因此其诊断与治疗均存在较大困难。

金黄色葡萄球菌在胞质中产生SCV 被认为是一种为了适应宿主细胞内环境所发生的一种适应性反应。多项体外研究已经证实金黄色葡萄球菌感染成骨细胞后可产生SCV[26,27]。Kalinka等[27]用慢性骨髓炎金黄色葡萄球菌临床分离株感染成骨细胞，结果显示随着成骨细胞毒性的下降，SCV 的比例逐渐升高。而关于成骨细胞内SCV形成的具体机制还尚未完全阐明。金黄色葡萄球菌的Sigma B 因子（Sig B）是目前被认为参与这一过程的重要因子。Tuchscherr等[28]发现胞内的金黄色葡萄球菌Sig B持续性表达上调可致黏附素的表达随之上调，而金黄色葡萄球菌毒力基因的表达却发生了下调，而此即为SCV的特征，从而说明Sig B 参与了SCV 的形成。此外，Tuchscherr等[29]研究亦发现当金黄色葡萄球菌从胞内释放重新感染其他细胞时，SCV可迅速转变为表达各种毒力因子的野生型。这可能也是骨髓炎持续感染和反复复发的原因。

SCV 因生长缓慢、对多种抗生素耐药等特性，可在成骨细胞内长期持留并不被抗生素杀灭，从而参与慢性骨髓炎的发病。目前对于成骨细胞内SCV的形成机制还尚未阐明，因此，进一步研究金黄色葡萄球菌发生SCV表型转换的关键分子将有助于开发慢性骨髓炎新的治疗靶点，而开发靶向SCV 的特异抗生素也将提高慢性骨髓炎的临床疗效。

3 炎症反应与凋亡

成骨细胞吞噬内化金黄色葡萄球菌后，可分泌多种炎症因子、趋化因子及抗菌肽，一方面，这种因子可降低成骨细胞的活性、促进成骨细胞凋亡，并且激活破骨细胞活性，从而使骨代谢失平衡，导致骨量的丢失；另一方面，这些因子通过招募并激活免疫细胞，启动宿主的固有免疫和适应性免疫。由于骨骼系统与免疫系统通过细胞因子存在相互作用，因此也衍生出了一门新的学科——“骨免疫学”[30,31]。骨免疫学最初主要研究破骨细胞的免疫调节作用，但随着研究的进展，其研究范畴已经延伸至破骨细胞与成骨细胞、成骨细胞与淋巴细胞、破骨细胞与淋巴细胞之间的相互作用。旨在通过研究骨骼系统与免疫系统之间相互作用的分子机制，从而寻找从免疫学上治疗骨骼系统疾病的新方法。

3.1 炎症因子、趋化因子及抗菌肽的分泌

Littlewood-Evans 等[32]于1997年就发现了感染金黄色葡萄球菌的成骨细胞中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α表达增加。随后，还发现了白介素（interleukin,IL）-6、IL-1β、IL-18 等炎症因子表达上升高[19,33,34]。但成骨细胞是否通过这些细胞因子参与感染后的炎症反应还尚未明确：一方面大多数体外研究使用的成骨细胞为细胞系，而非原代细胞，因此无法较好地模拟体内真实情况；其次，对于个别炎症因子，只有少数研究报道了在感染金黄色葡萄球菌后成骨细胞中存在该细胞因子或其编码基因表达增强；最后，在一些研究中，对于某些炎症因子，仅在mRNA水平上检测到其表达增加，而蛋白质水平上并未发现改变。此外，一些骨髓炎模型研究已经表明，当感染金黄色葡萄球菌后，专职性免疫细胞会被迅速激活，而成骨细胞感染金黄色葡萄球菌后，其mRNA水平在感染6～8 h才表达升高，而24～48 h后蛋白质水平才相应升高，且需要更大的感染复数（multiplicity of infection,MOI）和更长的感染时间[35,36]。综上所述，感染金黄色葡萄球菌后，成骨细胞分泌的炎症因子及其机制还尚未完全阐明，成骨细胞分泌的炎症因子在骨髓炎炎症过程中并不是发挥关键作用。

成骨细胞感染金黄色葡萄球菌后还可分泌多种趋化因子，招募并激活固有免疫和适应性免疫细胞。巨噬细胞是一种专职性吞噬细胞，在固有免疫中发挥作用，很容易被募集到骨关节感染部位的周围，成骨细胞分泌的趋化因子IL-6、C-C 类趋化因子配体（C-C motif chemokine ligand,CCL）2、CCL3 及CCL5 参与了巨噬细胞的募集和活化过程[37,38]。Bost等[39]研究发现感染后的成骨细胞可分泌人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)，从而促进各种白细胞的成熟。此外，成骨细胞还可通过增加IL-12、CXCL10（IP-10）的分泌和功能性CD40和主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）Ⅱ的表达而激活Th1淋巴细胞，参与适应性免疫[12,13]。然而，除了Th1细胞外，尚未有其他辅助性T细胞被募集和活化的报道。因此，感染后的成骨细胞是否启动适应性免疫还有待进一步研究。

除了分泌炎症因子及趋化因子外，成骨细胞还可分泌AMPs，从而保护自身免于细菌感染，包括α防御素、β 防御素及Cathelicidin 家族抗菌肽（在人类中主要为人类抗菌肽CAMP 活化产物LL-37）[40]。由于AMPs 可杀灭成骨细胞内金黄色葡萄球菌，较少出现耐AMP 菌株，因此将AMPs 添加到钛板上，用于治疗内植物相关性骨髓炎，可获得较好的治疗效果[40]。

炎症因子、趋化因子及AMPs的分泌是宿主抵抗金黄色葡萄球菌引起骨髓炎的重要过程。其中成骨细胞分泌的AMP对其胞内的金黄色葡萄球菌有较好的杀灭能力，且较少出现耐AMPs 细菌，因此，AMPs有望成为治疗慢性骨髓炎胞内感染（包括SCV）治疗的新药物，应进一步研究负载AMPs的生物材料在慢性骨髓炎中的治疗价值。

3.2 成骨细胞的凋亡

既往研究表明，金黄色葡萄球菌感染可诱导上皮细胞、成骨细胞发生凋亡[41,42]。成骨细胞的诱导性凋亡是金黄色葡萄球菌相关性骨髓炎的重要特征，一方面，成骨细胞的凋亡，可减少Ⅰ型胶原的产生及矿化，导致骨量丢失，另一方面，成骨细胞的凋亡可释放胞内的金黄色葡萄球菌，重新感染其他细胞，导致感染的进一步加剧[43]。

成骨细胞的这种诱导性凋亡被认为与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）有关[44]，TRAIL可与被感染成骨细胞上的死亡受体（death receptor,DR）4、DR5结合，触发细胞凋亡途径[45]。成骨细胞的凋亡途径包括内源性和外源性细胞凋亡途径，它们分别通过caspase-9和caspase-8，最后激活caspase-3并且诱导成骨细胞发生凋亡[18]。

3.3 骨代谢失平衡

在慢性骨髓炎中，可见大量的骨破坏和骨丢失，这与感染后成骨细胞的死亡、破骨细胞的数量及活性升高有关。

成骨细胞可产生NF-κB 活化受体配体(RNAKL)及骨保护素(osteoprotegerin,OPG)。RNAK-L 可与单核/巨噬细胞体上的配体RNAK 相结合，促进其分化为成骨细胞。而OPG 是一种可溶性诱骗受体，可与RANK 竞争性结合RANK-L，抑制破骨细胞的分化[46]。当金黄色葡萄球菌感染成骨细胞后，可导致RANK-L 合成增加，OPG 合成减少（尽管在mRNA 水平上并未检测到其表达下降），减少对破骨细胞分化的抑制[47,48]。通过金黄色葡萄球菌与成骨细胞相互作用后发生的这种改变，间接导致了破骨细胞数量的增多，最终致使骨代谢失平衡，骨量的丢失。此外，Somayaji 等[48]发现感染金黄色葡萄球菌后，成骨细胞可增加前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）的合成，PGE2可通过自分泌和旁分泌的方式激活成骨细胞的EP4受体，上调RANK的表达，促进破骨细胞的分化。

此外，研究也表明，成骨细胞分泌的趋化因子募集的T 细胞、白细胞等亦参与了骨代谢的调节，尤其是T细胞，可产生RANKL和IL-7，通过促进破骨细胞的分化导致骨代谢失平衡，造成骨量的丢失[49,50]。因此，成骨细胞产生的趋化因子通过募集免疫细胞，进而促进破骨细胞的分化亦参与了异常骨代谢中。

成骨细胞的凋亡，一方面可使细胞内金黄色葡萄球菌被重新释放，释放的细菌部分被中性粒细胞等免疫细胞杀灭，部分重新感染其他成骨细胞，引起慢性感染；另一方面，成骨细胞的凋亡使成骨细胞数量减少，同时激活破骨细胞活性，致使机体骨代谢失平衡，造成大量的感染性骨丢失。为此，应开发专门针对成骨细胞胞内菌的靶向药物，在杀灭胞内菌的同时最大程度保留成骨细胞数目，使骨髓炎得以控制并且减少感染性骨丢失。

4 总结与展望

成骨细胞吞噬内化金黄色葡萄球菌在骨髓炎发病机制中发挥了重要作用。金黄色葡萄球菌可利用MSCRAMM 与成骨细胞的受体或基质外蛋白发生粘附、内化，进入成骨细胞中，通过逃离吞噬溶酶体、SCV 表型转换等机制持留于胞质中。此后成骨细胞可分泌炎症因子、趋化因子及AMP，募集并激活免疫细胞，最终可诱导成骨细胞发生凋亡，破骨细胞的数量和活性升高，导致骨丢失，此时成骨细胞质中的金黄色葡萄球菌亦被释放，重新感染其他细胞，导致持续性感染和感染复发。今后应更加注重骨骼系统与免疫系统的联系，从骨免疫学角度探索减少金黄色葡萄球菌胞内持留、SCV表型转换及成骨细胞凋亡的新靶标，从而提高骨髓炎的临床治疗效果。