两种猕猴属动物肠道微生物多样性比较研究

赵俊松a,，张 梅a，桑正林，吴银梅

(昭通学院 a.科技处；b.农学与生命科学学院，云南 昭通 657000)

1 引言

动物与体内肠道微生物在长期的共生过程中，形成了一个相互影响、相互作用的整体系统[1, 2]，促使对动物肠道微生物组成结构的研究成为当今科学研究的热点，受到了广泛的关注。目前，相关研究结果显示人类的饮食、年龄、基因型、生活环境和相关疾病对体内肠道微菌群的组成都具有重要的影响作用[3-9]。而在动物的整个进化过程中，肠道微生物是否会产生相应的协同进化也是目前的研究热点。通过分子生物学手段和宏基因再测序技术研究发现，宿主基因与肠道微生物结构间存在着密切的联系，宿主肠道微生物群落结构存在着个体差异的特性[10]。对同卵双胞胎和没有血缘关系人群的肠道微生物结构的比对分析发现，宿主的基因型对肠道微生物组成结构具有显著的影响，同卵双胞胎肠道微生物的组成结构相似度比没有血缘关系的人群肠道微生物组成结构更相似[11]。Goodrich等人[3]对来自英国的1 000对双胞胎肠道微生物进行对比分析也揭示了肠道微生物多样性受宿主遗传学影响。即相关结果揭示了宿主肠道微生物的组成与宿主的遗传背景间存在重要的联系。因此，了解特定动物类群中共有的肠道微生物的组成结构，对研究动物肠道微生物与宿主本身的协同进化具有重要意义。

非人灵长类动物(Non-human primates)起源于热带雨林地区，经过辐射扩散作用进入到温带低地地区[12]，目前对相应肠道微生物组成结构的研究结果分别揭示了白眉长臂猿(Hylobateshoolock)、黑猩猩(Pantroglodytes)、川金丝猴(Rhinopithecusroxellanae)[13]黑吼猴(Alouattacaraya)[14,15]、狐猴(Eulemurcollaris)[16]、藏酋猴[17]、食蟹猴(Macacafascicularis)[18]和恒河猴[19]等非人灵长类动物的肠道微生物组成结构。同时，相关灵长类动物分布研究结果显示，在中国分布着7种猕猴属灵长类动物，其中恒河猴和藏酋猴在中国境内分布最广，数量较多；但相应的研究主要集中在揭示单个物种组成结构特征，对同属动物间的肠道微生物组成结构进行比对分析的研究较少，特别是对生活环境相似，食性相似的同属灵长类动物的肠道微生物结构特征的对比研究较缺乏；而藏酋猴和恒河猴在中国的分布广、数量多、食性和生活环境相似且均属于猕猴属非人灵长类动物，是研究动物属间肠道微生物组成结构特征的理想选择。因此，本研究基于上述研究对恒河猴和藏酋猴肠道微生物的高通量测序鉴定结果进行整理分析；比较两种食性相似、生活环境相似的猕猴属非人灵长类动物肠道微生物组成结构；揭示其食性、遗传和其他生活环境因素对动物肠道微生物组成结构的影响机制；为猕猴属灵长类动物肠道微生物相关研究提供理论依据，同时为研究动物肠道微生物与宿主本身的协同进化提供新的见解。

2 材料与方法

本研究的研究对象藏酋猴和恒河猴均属于猕猴属中分布较为广泛的类群，其中藏酋猴属于猕猴属动物中体型较大的一个类群，也是中国特有的灵长类动物之一，其主要分布于中国的中部地区，东至浙江、福建，西到四川，北达秦岭南部，南至西藏南部[20]。粪便样本来源于中国安徽黄山(118°11′W, 30°29′N)，平均海拔1841m，地处温带和亚热带交界地带[21]；通过相关研究者的跟踪调查发现其栖息地为落叶和常绿阔叶混合山地森林，其摄食的食物一般包括包括树叶、水果、草，还有少量植物的花、根和昆虫等，属于杂食性灵长类动物[22,23]。恒河猴是目前世界分布最广的非人灵长类动物，主要分布于南北回归线之间的热带和亚热带地区，主要集中分布在中国大部至印度尼西亚间的南亚各国和日本[24]。在中国，除靠北的新疆、内蒙、宁夏和东北外，其余各省均有恒河猴分布，属于较为常见的非人灵长类动物[24]；其食物资源主要包括植物果实、花、树叶和嫩芽等，且随季节变化会存在一定的差异[25]。本研究的样本来源于中国的西藏、大理、贵阳、南宁、西昌和海口六个野生恒河猴集聚区，其生活环境以常绿阔叶林为主。

本研究通过对Zhao等(2018)对恒河猴肠道微生物16SrRNA的高变区进行测序揭示了36个野生恒河猴肠道微生物组成结果[19](从已发表的论文和联系作者获取的相关数据)和Sun等(2016)对藏酋猴肠道微生物的16SrRNA的高变区进行测序揭示了48个野生藏酋猴肠道微生物组成结果(从已发表的论文中获取的数据)[17]进行数据整理分析；由于上述研究均是基于16SrRNA对动物肠道微生物菌群的研究，虽然所测区域存在差异，但通过序列比对后对动物肠道微生物的鉴定数据能准确揭示出动物肠道微生物的组成特征，所以本研究基于上述研究对恒河猴和藏酋猴肠道微生物的高通量测序鉴定结果进行整理分析；比对两种猕猴属非人灵长类动物肠道微生物组成结构；通过Excel比对恒河猴和藏酋猴肠道微生物在门分类水平和属分类水平上的共有和特有菌群，计算所占百分比，并通过VN图进行作图展示；通过Origin pro 2018对相关数据进行箱线图制作并通过SPSS2.0对相关数据进行T值检验。揭示两种在中国广泛分布的两种猕猴属动物肠道微生物组成结构特征；揭示猕猴属动物肠道微生物的组成结构。

3 结果

3.1 恒河猴和藏酋猴肠道微生物在门分类水平上的组成特征

我们将恒河猴和藏酋猴两种猕猴属动物肠道微生物在门分类水平上丰富度>0.01%的菌群进行分析比较发现，恒河猴和藏酋猴肠道微生物组成中均以Firmicutes和Bacteriodetes占主导地位，但丰富度存在差异；其中在门分类水平上Firmicutes(Mt=43.43±8.50%; Mm=53.60±8.65%)、Bacteriodetes(Mt=35.20±6.39%; Mm=33.60±11.87%)、Proteobacteria(Mt=14.66±8.77%; Mm=0.75±0.44%)、Actinobacteria(Mt=0.48±0.62%; Mm=1.55±1.29%)和Spirochaetia(Mt=2.03±2.25%; Mm=1.36±1.83%)菌群为恒河猴和藏酋猴共有的肠道微生物。Verrucomicrobia为藏酋猴种群特有肠道微生物；Tenericutes、Cyanobacteria和Fibrobacteres为恒河猴种群特有肠道微生物。恒河猴和藏酋猴共有菌群丰富度占藏酋猴肠道微生物总量的95.81%，占分离鉴定出种类丰富度的98.96%；占恒河猴肠道微生物总量的90.87%，占分离鉴定出种类丰富度的91.34%(图1)。为了更进一步的揭示藏酋猴和恒河猴共有肠道微生物在门分类水平的丰富度特征，我们对两者共有的5种肠道微生物丰富度进行了T值配对检验结果显示，在门分类水平上，藏酋猴和恒河猴肠道微生物中Firmicutes(T=-4.984，df=35，P<0.05)、Proteobacteria(T=9.851，df=35，P<0.05)和Actinobacteria(T=-4.446，df=35，P<0.05)丰富度均存在显著差异(图1)。其中在恒河猴肠道微生物中Firmicutes和Actinobacteria丰富度显著高于藏酋猴；藏酋猴肠道微生物中Proteobacteria丰富度显著高于恒河猴。

图1 恒河猴和藏酋猴肠道微生物门分类水平的比较(丰富度>0.01%);a.VN图表示重叠种类；b.重叠菌群丰富度箱线图,“*”表示差异性显著，P<0.05.

Fig.1 Comparison of gut microbiota phylum levels between rhesus macaques and Tibetan macaques (richness >0.01%); a.VN maps indicate overlapping species; b. overlapping flora abundance box plots, "*" indicates differences Significantly significant, P<0.05.

3.2 恒河猴和藏酋猴肠道微生物在属分类水平上的组成特征

我们将恒河猴和藏酋猴两种猕猴属动物肠道微生物在属分类水平上丰富度>0.01%的菌群进行比较发现，在属分类水平上，藏酋猴和恒河猴肠道微生物中共有菌群共有13种，包括Succinivibrio、Helicobacter、Faecalibacterium、Oscillibacter、Alloprevotella、Dialister、Blautia、Roseburia、Lachnospiracea、Catenibacterium、Anaerostipes、Flavonifractor和Dorea。其中Prevotella、Porphyromonadaceae和Treponema等17个属为藏酋猴种群特有肠道微生物；Lactobacillus、Megasphaera和Subdoligranulum等28个属为恒河猴种群特有肠道微生物。恒河猴和藏酋猴共有菌群丰富度占藏酋猴肠道微生物总量的27.43%，占分离鉴定出种类丰富度的50.63%；占恒河猴肠道微生物总量的9.31%，占分离鉴定出种类丰富度的42.21%(图2)。对两者共有的13种肠道微生物丰富度进行了T值配对检验结果显示，在属分类水平上，藏酋猴和恒河猴肠道微生物中Succinivibrio(T=13.318，df=36，P<0.05)、Helicobacter(T=5.558，df=36，P<0.05)、Oscillibacter(T=5.591，df=36，P<0.05)、Blautia(T=-3.417，df=36，P<0.05)、Lachnospiracea(T=5.108，df=35，P<0.05)、Catenibacterium(T=-4.162，df=36，P<0.05)、Flavonifractor(T=5.098，df=36，P<0.05)和Dorea(T=-4.663，df=36，P<0.05) 8中菌群丰富度均存在显著差异(图2)。其中在恒河猴肠道微生物中Blautia、Catenibacterium和Dorea丰富度显著高于藏酋猴；藏酋猴肠道微生物中Succinivibrio、Helicobacter、Oscillibacter、Lachnospiracea和Flavonifractor丰富度显著高于恒河猴。

图2 恒河猴和藏酋猴肠道微生物属分类水平的比较(丰富度>0.01%);a.VN图表示重叠种类；b.重叠菌群丰富度箱线图,“*”表示差异性显著，P<0.05.

Fig.2 Comparison of gut microbiota genus levels between rhesus macaques and Tibetan macaques (richness >0.01%); a.VN maps indicate overlapping species; b. overlapping flora abundance box plots, "*" indicates differences Significantly significant, P<0.05.

3.3 藏酋猴、恒河猴和食蟹猴肠道微生物在属分类水平上的特征

为了更进一步的揭示猕猴属非人灵长类动物肠道微生物在属分类水平上的组成特征，我们将恒河猴和藏酋猴肠道微生物在属分类水平上的丰富度>0.01%的菌群平均丰富度与Li等在2018年所测得的食蟹猴肠道微生物在属分类水平上的丰富度>0.01%的菌群平均丰富度[18]进行比较分析发现，在属分类水平上，藏酋猴、恒河猴和食蟹猴肠道微生物中共有菌群共有7种(图3)，包括Catenibacterium、Dialister、Faecalibacterium、Blautia、Dorea、Roseburia和Helicobacter。其中恒河猴与食蟹猴共有菌群包括Lactobacillus、Megasphaera和Subdoligranulum等15种；藏酋猴与食蟹猴共有菌群包括Prevotella、Ruminococcus和Clostridium等5种；恒河猴与藏酋猴共有菌群包括Succinivibrio、Lachnospira和Oscillibacter等4种。其中Helicobacter菌群丰富度在藏酋猴中的丰富度较高；Catenibacterium、Dialister、Faecalibacterium和Blautia菌群丰富度在恒河猴中的丰富度较高；而食蟹猴在共有的7中肠道微生物丰富度均较低(图3)。

图3 恒河猴、藏酋猴和食蟹猴肠道微生物属分类水平的比较(丰富度>0.01%); a.VN图表示重叠种类；b.重叠菌群丰富度柱状图.

Figure 3 Comparison of the taxonomic levels of the gut flora of rhesus macaques, Tibetan macaques and cynomolgus macaques (richness >0.01%); a.VN maps indicate overlapping species; b. overlapping flora abundance histograms.

4 讨论

4.1 猕猴属灵长类动物肠道微生物门分类水平组成特征分析

我们的分析结果显示，在肠道微生物门分类水平上Firmicutes、Bacteriodetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Spirochaetia菌群为恒河猴和藏酋猴共有的肠道微生物，其中藏酋猴上述5个门菌群丰富度占整个肠道微生物丰富度的95.81%，其中Firmicutes和Bacteriodetes丰富度占总丰富度的78.64%；恒河猴上述5个门菌群丰富度占整个肠道微生物丰富度的90.87%，其中Firmicutes和Bacteriodetes丰富度占总丰富度的87.20%；这与人类和其他哺乳动物的肠道微生物组成结构相似[26,27,28]，以Firmicutes和Bacteriodetes占主导地位；先前的相关研究结果揭示了动物肠道微生物中的Firmicutes中含有大量能够编码与动物能量代谢相关的酶的基因，能够编码产生多种动物体内的消化酶，帮助宿主消化分解多种大分子物质，促进宿主对相关营养物质的吸收作用[29]。而Bacteriodetes的主要功能则是降解宿主体内的糖类物质和蛋白质物质，促进对糖水化合物的分解作用[30-33]。这或许也表明Firmicutes和Bacteriodetes在哺乳动物中的丰富度高与其宿主的环境适应机制存在一定的协同作用，高丰富度的Firmicutes和Bacteriodetes能有效的促进其宿主的食物消化过程，有助于其能量的摄取，从而增强其对不同生活环境的适应性。另外我们还发现在猕猴属的恒河猴和藏酋猴动物肠道微生物中还存在着一定量的Proteobacteria、Actinobacteria和Spirochaetia菌群，尽管目前对相关菌群对宿主所产生的功能还不明确，但在对猕猴属另一种动物食蟹猴肠道微生物的组成的研究中也发现含有一定量的上述菌群[18]，或许这表明Firmicutes、Bacteriodetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Spirochaetia在猕猴属非人灵长类动物肠道微生物的组成结构中扮演着核心菌群的角色；丰富度的变化或许与其环境适应性存在联系更大。

本研究的结果还显示了，在猕猴属灵长类动物中恒河猴和藏酋猴的肠道微生物中均存在部分种群特有菌群，在门分类水平上恒河猴特有的菌群包括Tenericutes、Cyanobacteria和Fibrobacteres，藏酋猴种群特有肠道微生物包括Verrucomicrobia，而目前的研究揭示Verrucomicrobia属于土壤环境中的优势菌群[34]，但对于其在动物肠道中的因果关系并不明确，需要进一步的研究确定。同时，恒河猴肠道微生物菌群中存在的种群特有菌群与宿主的相关作用机制目前的研究报道较缺乏，相关作用机制也不明确；但叶莉等学者在2015年的中国畜牧兽医学会动物传染病学分会上的摘要报道揭示了在中国不同恒河猴种群体内均存在上述三种菌群，其推测该类菌群的丰富度与食性和环境生态存在一定关系[35]。或许这类菌群的存在与动物生活的环境存在一定的相关性，但具体的因果关系需要进一步的研究进行揭示确定。

4.2 猕猴属灵长类动物肠道微生物属分类水平组成特征分析

由于实验方法的差异和现有数据库数据量的限制使其先前的研究对恒河猴和藏酋猴肠道微生物在属分类水平上分离鉴定出的菌群占总体的比例较小，但对其已鉴定出来的菌群对揭示动物肠道微生物的组成结构也具有重要意义。因此，我们对已鉴定出的肠道微生物在恒河猴和藏酋猴肠道微生物属分类水平上的比对发现Succinivibrio、Helicobacter、Faecalibacterium、Oscillibacter、Alloprevotella、Dialister、Blautia、Roseburia、Lachnospiracea、Catenibacterium、Anaerostipes、Flavonifractor和Dorea为其共有的肠道微生物，与Li等在2018年研究得到的食蟹猴肠道微生物[18]在属分类水平上的丰富度>0.01%的菌群平均丰富度进行比较分析发现，在属分类水平上，藏酋猴、恒河猴和食蟹猴肠道微生物中共有菌群共有7种，包括Catenibacterium、Dialister、Faecalibacterium、Blautia、Dorea、Roseburia和Helicobacter。其中相关研究显示Blautia具有水解植物葡糖神经酰胺(GluCer)能力的菌株[36]，这或许与其猕猴属动物属于杂食性的食性有关，该菌群在宿主对植物性食物的消化中具有重要作用；Dialister是一种导致人类牙周炎的病原菌[37]，或许这与猕猴属动物属于杂食性动物也存在一定的联系；Roseburia是一种从人类粪便中分离出来，在机体糖酵解过程中产丁酸的菌群[38]，与宿主的能量代谢存在一定联系。而目前的研究结果揭示Helicobacter和Faecalibacterium丰富度可能与动物体的健康程度存在一定关系[39-41]，对其与宿主间的协同适应机制并不确定，有待进一步的研究揭示。尽管其上述7种菌群在恒河猴、藏酋猴和食蟹猴中的丰富度存在差异，但这在三种猕猴属动物肠道微生物中均存在，且部分菌群与其食性存在相应关系；或许表明在动物适应性进化过程中，肠道微生物的组成结构受动物食性和生活环境的影响更大。通过对比我们发现在恒河猴、藏酋猴和食蟹猴体内肠道微生物中存在包括Lactobacillus、Ruminococcus和Fibrobacter等大部分种群特有菌群。目前的相关研究也揭示了Lactobacillus[42]、Ruminococcus[43]和Fibrobacter[44]等菌群与动物的食性和代谢存在一定的关系。这或许从另一方面证明了动物适应性进化过程中，肠道微生物的组成结构与动物食性和生活环境的协同作用更明显。

综上所述，我们发现在猕猴属动物肠道微生物组成门分类水平中Firmicutes、Bacteriodetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Spirochaetia作为核心菌群存在于猕猴属非人灵长类动物肠道中，在属分类水平中Catenibacterium、Dialister、Faecalibacterium、Blautia、Dorea、Roseburia和Helicobacter作为核心菌群存在于猕猴属非人灵长类动物肠道中；从门分类水平和属分类水平中，猕猴属动物肠道微生物共有核心菌群所占比例显著大于种群特有菌群，但在不同物种中丰富度存在显著差异；或许表明环境和食性等其他因素比遗传效应对动物肠道微生物组成结构的影响更大。通过对猕猴属的两种非人灵长类动物肠道微生物组成结构的对比综述，我们发现目前的相关研究主要集中在揭示动物类群的肠道微生物组成结构方面，对其肠道微生物与宿主间的协同适应机制的研究报道也主要是肠道微生物的组成结构方面，所得结论并不能揭示其具体的适应机制；特别是对相关菌群与宿主间的作用机理的研究较缺乏，后续的相关研究可以通过相应验证性试验研究，从而准确的揭示肠道微生物与宿主协同适应机制。