生物制剂和生物技术治疗天疱疮进展

孙菲菲 杨宝琦

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院)，山东省皮肤病性病防治研究所，山东济南，250022

天疱疮(pemphigus)是一种抗原抗体结合导致的大疱性皮肤病。根据临床及病理特征分为四型，即寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris, PV)，落叶型天疱疮(pemphigus foliaceus, PF)，红斑型天疱疮(pemphigus erythematosus, PE)和增殖型天疱疮(pemphigus vegenate)。天疱疮治疗包括局部治疗和系统性治疗。对于轻度且稳定的天疱疮，外用糖皮质激素治疗局限性皮损可减少系统性治疗的不良反应，表现出一定的疗效。为了控制中重度天疱疮患者病情进展，根据个体化情况，及时开始系统性治疗。目前系统性治疗首选药物是糖皮质激素，常联合应用免疫抑制剂(如吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤、环磷酰胺、氨苯砜、硫唑嘌呤等)。除此之外，对于难治性重症患者，常加用辅助免疫疗法，以挽救患者生命，主要包括：静脉免疫球蛋白输注(intravenous immunoglobulin, IVIG)、免疫吸附、血浆置换等。生物技术是利用生物体或其组成部分来产生有用物质从而提供服务的技术，医学应用主要包括基因工程、细胞工程等。目前各种医学生物技术治疗方案不断涌现，为治疗甚至治愈天疱疮带来希望。本文综述天疱疮生物制剂及生物技术治疗进展。

1 利妥昔单抗(Rituximab, RTX)

RTX是一代抗CD20单抗，是应用基因工程技术研制的人鼠嵌合抗体，以B淋巴细胞表面的CD20抗原为靶点，从而导致B淋巴细胞的清除[1]。RTX在天疱疮的治疗中已有一定规模的实践并且取得了良好的疗效。从难治性天疱疮的辅助治疗到一线治疗，RTX的效果得到了充分认可。RTX 治疗天疱疮目前以淋巴瘤方案和类风湿关节炎的方案为主。淋巴瘤方案为每周静脉滴注 RTX 375 mg/m2，连用4周；类风湿关节炎方案为每周静脉滴注RTX 1000 mg，连用2周[2]。根据患者病情，第12、18个月可以再次使用500 mg。一项RTX联合短期泼尼松与单独泼尼松治疗天疱疮的前瞻性、多中心、开放的随机试验结果显示一线联合RTX治疗缓解率更高，不良事件更少[1]。应用RTX后半年内患者可停用泼尼松治疗并且缓解维持时间明显延长[1]。RTX一线治疗天疱疮的临床研究发现临床缓解情况与RTX剂量以及患者年龄等因素相关[3]。一项系统性回顾性研究分析了1085例RTX治疗天疱疮疗效，结果显示RTX具有良好的安全性和有效性，可以使天疱疮患者获得长期缓解，并且联合IVIG或者免疫吸附等治疗效果良好[4]。由于RTX对B淋巴细胞的作用无选择性，且RTX为人鼠嵌合抗体，可能出现一定的不良反应，主要包括过敏反应，输注反应(如头痛、血管性水肿、恶心、呕吐、发热、寒战)，感染风险等，进行输注时需进行监测。RTX临床应用广泛，国际专家共识已推荐RTX为中重度天疱疮患者一线治疗方案[5]。

2 造血干细胞移植

造血干细胞移植是指应用健康的造血干细胞，重建患者血液及免疫系统的治疗方法[6]。根据造血干细胞来源，可分为自体和异基因造血干细胞移植。由于配型困难并且存在发生移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)风险，异基因造血干细胞移植在天疱疮治疗应用较为受限。自体造血干细胞移植主要步骤包括造血干细胞动员，造血干细胞采集，预处理和干细胞回输[7-9]。常见的动员方案包括环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)、利妥昔单抗、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)，ATG也常联合应用从而去除T细胞和B细胞[9]。移植前预处理方案常联合应用CTX、ATG和利妥昔单抗等，从而清除患者体内异常免疫细胞，达到高度免疫抑制或免疫清除的目的[7，10]。患者自身免疫清除后，重新输注的造血干细胞产生新的淋巴系和髓系的祖细胞，并在胸腺重新经历阳性和阴性选择，产生自身免疫耐受的原始T淋巴细胞和Treg细胞，从而稳定天疱疮病情[11]。造血干细胞移植治疗天疱疮已有临床实践证实其可行性，并取得了满意疗效。2004年，国内学者实现了国内首次自体外周血纯化CD34+造血干细胞移植治疗难治性天疱疮。移植后患者恢复良好，停用激素等其他治疗，天疱疮抗体转阴，皮肤病理免疫荧光转阴，效果佳。随后进行了更大规模的自体造血干细胞移植治疗难治性天疱疮试验，共纳入12例天疱疮患者，总生存率为91.6%，仅一例患者因胃肠功能障碍死亡，临床完全缓解率(75%)较传统治疗高，且可停用糖皮质激素治疗[7]。国外研究发现在难治性PF患者，自体造血干细胞移植治疗也取得了良好的疗效，患者停用系统性糖皮质激素治疗且未复发[12]。其主要不良反应是发热和感染(细菌、败血症、病毒、真菌等)[7]。此外还可能出现转氨酶升高、过敏反应和自身免疫性溶血等不良反应，大多经治疗后可恢复。

造血干细胞移植作为一种新兴的有效治疗天疱疮的生物技术，为复发难治的患者提供了希望，然而由于费用昂贵、存在一定风险等因素，目前临床病例数量仍相对较少，阻碍了对该方法进一步的探究和推广运用。治疗天疱疮虽已临床证实可行，但相关的基础研究仍相对匮乏，并且目前尚无统一的纳入标准和标准化的治疗方案，仍是存在的问题。因此需要进一步试验验证，建立一套完整的临床指南，积极预防其可能发生的不良反应，形成治疗体系，有利于其进一步发展。

3 间充质干细胞治疗

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)可以自我更新，并向非间充质细胞转化，还可产生营养因子和生长因子等[13]。MSC来源广泛，除骨髓外，亦可从几乎所有的成体组织中分离培养，如胎盘、 脐带、脐血及脂肪组织等[14]。间充质干细胞具有低免疫原性，使其拥有免疫豁免权，能够逃避免疫识别和清除，诱导免疫耐受[15，16]。MSC可抑制包括T、B淋巴细胞在内的多种免疫细胞的增殖反应，并影响免疫细胞的细胞因子分泌，具有强大的免疫调节作用[17，18]。这些免疫特性对于治疗自身免疫性疾病具有诱人的治疗潜力。间充质干细胞药物如Prochymal，Remestemcel-L等已被批准应用于GVHD的治疗[19，20]。2010年一例难治性天疱疮患者进行了脐带间充质干细胞输注辅助治疗，短期随访显示效果可观，患者皮损减轻，Dsg抗体减少，糖皮质激素减量后皮损也未加重，长期随访尚未知[21]。

间充质干细胞来源广泛，具有免疫豁免，对移植前的免疫清除没有严格要求，安全有效，临床更易推广。其最常见的并发症为发热及胃肠道症状，对症处理后均可好转[13]。但间充质干细胞治疗主要机制是免疫调节作用，不能从根源重建患者免疫，不能完全根治疾病。尚需对间充质干细胞进行修饰进一步强化其免疫调节作用，从而达到稳定疾病的目的。

4 调节性T细胞过继治疗

调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)是一类控制体内自身免疫反应的T细胞亚群，占外周血淋巴细胞的1%～2%[22]。Tregs主要包括以下三类细胞：自然调节性T细胞-CD4+CD25+T细胞、适应性调节性T细胞和CD8+T细胞[23]。Tregs是机体以“主动”方式来维持免疫内环境稳定的主要途径，可抑制效应T细胞活化增殖，影响体液免疫，对单核细胞/巨噬细胞也有抑制作用[24-26]。天疱疮的发病与Tregs具有显著相关性，PV患者Tregs显著减低，Th17(T helper cell 17)细胞增多，导致免疫失调[27]。PV患者Tr1(type 1 regulatory T cell)细胞缺乏，研究发现Tr1细胞可能在维持和恢复对Dsg3自身抗体的耐受性中起关键作用[28]。HLA转基因PV小鼠模型中，CD28诱导单克隆Tregs可降低Dsg3抗体滴度[29]。Tregs在诱导和维持自身抗原耐受及防止自身免疫发生中起重要作用，有望成为天疱疮的治疗手段。

Tregs过继治疗(adoptive cell therapie, ACT)是利用自身Tregs进行体外扩增培养(修饰/不修饰)，然后回输到体内，从而实现免疫调节及耐受。其分为自体Tregs过继治疗和工程抗原特异性受体Tregs过继治疗。自体Tregs过继治疗根据特异性与否分为多克隆和单克隆自体Tregs治疗。动物试验已证实过继转移CD4+CD25+Tregs以剂量依赖的方式抑制PV模型小鼠Dsg3自身抗体的产生[30]。目前关于多克隆自体Tregs过继治疗天疱疮的开放性多中心一期临床试验已经开展(NCT03239470)。但有研究提示多克隆自体Tregs过继治疗存在抑制肿瘤和感染性疾病的保护性免疫的风险[31]。单克隆自体Tregs过继疗法是通过体外表面抗原或抗原提呈细胞刺激诱导Tregs特异性单克隆分化，但是反复刺激Tregs可能导致细胞不稳定增殖，产生非Tregs，并且单克隆分化Tregs数量有限。目前更精确的靶向治疗是工程抗原特异性受体Tregs过继治疗，其利用基因工程技术，将调节性T细胞激活，并且表面嵌合特异性受体进行修饰，从而靶向损害效应T细胞等免疫细胞，从而实现免疫抑制的靶向调节，促进免疫耐受。主要包括三种：嵌合抗原受体Tregs(CAR-Tregs)、T细胞(抗原)受体(T cell receptors, TCR)-Tregs以及B细胞抗体受体(B-cell antibody receptors, BAR)-Tregs。CAR-Tregs是指通过基因工程技术构建载体转移到Tregs，使Tregs表面表达特定的抗原受体，以此来识别靶细胞上特异性抗原并激活Tregs，并通过MHC不受限制的方式杀死抗原承载细胞，从而实现靶向精准治疗[32，33]。TCR-Tregs是将抗原特异性TCR基因导入患者Tregs，体外扩增后回输到患者体内。TCR-Tregs靶向杀伤细胞是一种MHC依赖性方式，并且需要大剂量IL-2等细胞因子刺激，因此没有CAR-Tregs应用广泛[34，35]。BAR-Tregs可被致病组织B淋巴细胞表面的B细胞受体(B cell receptor, BCR)所识别结合，从而减少抗体分泌，是一种MHC非限制性作用方式[36]。作为一种新兴技术，BAR-Tregs仍研究较少。下面以CAR-Tregs为例来说明工程抗原特异性受体Tregs过继治疗的步骤：①分离纯化患者Tregs：从外周血中分离得到外周单核细胞，再通过磁珠分选得到Tregs；②改造Tregs：用基因工程技术，把一个含有能特异性识别且激活Tregs的嵌合抗原受体的病毒载体转入Tregs，即把Tregs改造成CAR-Tregs；③体外扩增CAR-Tregs；④CAR-Tregs回输至患者体内。

多克隆自体Tregs过继治疗存在广泛抑制而诱发肿瘤和感染的风险，单克隆自体Tregs过继治疗稳定性及数量不足问题尚待解决。工程抗原特异性受体Tregs通过对Tregs进行修饰，解决了上述问题，是天疱疮的理想治疗方法。但工程抗原特异性受体Tregs过继治疗天疱疮目前仅在基础实验和动物试验阶段，不良反应严重程度尚需进一步研究。构建高效特异的工程抗原特异性受体Tregs至关重要，需要深入开展研究。回输至患者体内的Tregs需是激活状态，因此回输前需确认修饰的Tregs的激活。工程抗原特异性受体Tregs疗效的持久性问题也需要解决，是否可以通过结合端粒酶逆转录酶共转导，联合应用PI3K抑制剂等实现尚在研究中[37，38]。目前工程抗原特异性受体Tregs过继治疗诸多问题尚待解决，其治疗天疱疮尚无临床试验开展，需要积极进行机制研究及动物试验，并逐渐推广至临床。

5 调节性B细胞过继治疗

调节性B细胞(regulatory B cells, Bregs)作为免疫抑制细胞，同样有一定的负向免疫调节作用，并且研究表明T-B细胞间相互作用在天疱疮发病中具有不可替代的作用[39]。有研究表明，向致病小鼠过继转移野生型小鼠的Bregs后原本被抑制的Tregs水平可恢复，因此认为Bregs过继治疗可通过影响Tregs从而发挥免疫调节作用[40]。进一步机制研究发现Bregs主要依赖于其分泌的IL-10的作用，从而抑制了前体细胞向Th1细胞分化，使其转化为Tregs[40，41]。目前Bregs过继治疗仅在体外试验和动物试验证实，尚无临床试验开展，治疗效果仍未确定。

6 小结

天疱疮作为一种自身免疫性疾病，临床易反复，目前尚无特异性治疗。糖皮质激素联合免疫抑制剂等传统治疗方法不良反应明显，利妥昔单抗作为一种生物制剂，从难治性天疱疮辅助治疗到推荐一线治疗，展示出良好的治疗价值。造血干细胞移植已成功应用于天疱疮治疗，并且取得了突出成就，临床疗效可观，但其治疗费用较高，风险较大，步骤繁琐，限制了其临床推广。Tregs是一类诱导免疫耐受，抑制免疫功能的T细胞，已证实在天疱疮发病中发挥了不可或缺的作用。临床前研究证实Tregs过继疗法在天疱疮动物模型中疗效良好，并且多克隆自体Tregs过继疗法治疗天疱疮已进入I期多中心临床试验。工程抗原特异性受体Tregs可靶向调节免疫，成为当下研究热点。但是这些前沿治疗给予希望的同时也充满了挑战。Tregs纯化、Tregs谱系稳定性、基因工程修饰技术和不良反应防治等一系列问题需要解决，从临床前研究到临床试验，逐渐推广到临床，再到国际化指南的建立还有很长的路要走。