Notch1在胰腺癌中的应用

李元颖 张贝贝 姚俊

胰腺癌是一种消化道肿瘤，具有较高的发病率、病死率，且近年来呈上升趋势，其起病隐匿，发展迅速，早期无明显症状，发现时，多为晚期或转移症状[1]。随着医疗技术的不断发展，人们对癌症的深入研究，发现信号转导通路在肿瘤的发展过程中有重要作用，诸如Notch信号通路，其参与肿瘤血管生成、细胞迁移、组织再改造[2]。国内外很多学者经过深入研究，均认为Notch信号通路在胰腺癌的发生发展中有着重要作用[3-5]。Notch及其相关分子是一类十分重要的信号受体蛋白家族，最早发现于脊椎动物和无脊椎动物，该信号可以通过局部细胞间的相互作用，实现通讯、信号传导及转录，控制细胞增殖、 凋亡等活动。对该信号通路进行研究，发现其主要由受体、配体及CSL蛋白、信号效应分子组成。在人体中，Notch信号通路分为Notch1、Notch2、Notch3、Notch4这4个受体，通过与配体相互作用，参与肿瘤活动，其中以Notch1受体研究最多，而其他则较少。有很多学者，进行免疫组化法研究，结果显示：Notch1在多种肿瘤细胞中高表达，且与部分病理特征及预后有关[6-8]。部分学者在研究Notch1受体在乳腺癌中的表达状态，发现乳腺癌早期其蛋白呈高表达，随着疾病的进展，其表达呈上升趋势，但其不是影响预后的1个独立危险因素，认为Notch1和JAG-1共同高表达与乳腺癌的预后不良有关[9,10]。在乳腺癌中，Notch1受体起到促癌作用，但不能作为预后的独立因素。而Notch1受体在结肠癌组织中呈高表达，且与病理级别、肿瘤进展、转移呈正相关，其高表达状态可提示结肠癌患者的预后不良[11,12]。表明Notch1受体在结肠癌的发生发展中起到促癌作用，且与其病理特征及预后关系密切。而在肝癌中呈低表达，表明：肝癌中，Notch1可能发挥着抑癌作用[13]。但对于胰腺癌来说，Notch1受体的作用仍存在着较大的争议，故而，本文就胰腺癌中，Notch1受体的影响进行综述，以便为胰腺癌的分子机制提供参考。

1 Notch信号通路简介

Notch信号通路是一条信号转导通路，可影响细胞的命运，具有保守的特点，它几乎参与所有细胞的增殖、分化，因此对于调节细胞分化、增殖、凋亡，及其一系列的病理生理过程，均具有较为重要的作用。不同器官、组织中，Notch受体可能发挥着不同的作用[14-16]。研究显示，肿瘤发展及器官发育均存在着相似的信号调控过程[17]，因此Notch信号通路在胚胎发育期及肿瘤形成过程中，均具有决定性作用。

1.1 Notch蛋白的由来 Notch是1917年，Morgan首先发现的，是存在于果蝇体内的一种基因，如缺失，果蝇在形态上会发生明显变化—翅膀边缘缺口。此后，逐渐发现：果蝇及其他众多的生命体内普遍存在Notch受体蛋白的同源分子，这一发现提示：在物种进化中，Notch蛋白有着关键的地位，且这种地位是恒定的。

Notch信号通路主要包括受体、配体(DSL蛋白)和CSL(一类DNA结合蛋白)，前两个主要表达在细胞膜上。无论是无脊椎动物，还是哺乳动物，均存在受体蛋白的同源分子，在哺乳动物中，共有4个Notch受体，分别标记为1、2、3、4。

1.2 Notch信号途径 在胚胎发育中，位于上皮组织中的前体细胞分化的神经元细胞表面的Notch配体Delta结合相邻细胞膜上的Notch，启动信号途径，并预防类似的现象，此种现象称之为侧向抑制[18]。Notch突变在胚胎期死亡后，上皮组织被神经组织取代，使得神经组织异常丰富。

Notch及其配体均为单次跨膜蛋白，当配体结合相邻细胞的Notch后，释放出具有核定位信号功能的ICN(intracellular domain of Notch)，以调节基因表达[19]。Notch蛋白，分子量约300 kD，果蝇有1个，而人类4个(Notch1、2、3、4)。

胞外区是结合配体区域，包含EGF样重复序列(EGF-R)和LNR(Lin/Notch repeats)。胞内区由RAM结构域、PEST结构域及锚蛋白重复序列、核定位信号(NLS)。前2个结构域分别是CSL结合区域、Notch的降解区域。Notch蛋白需经历3次切割：切割部分分别是高尔基体内及胞外区。第1次被furin切割为2个片断，转运至细胞膜，形成异二聚体。当配体结合后，Notch蛋白又发生2次断裂，分别是被肿瘤坏死因子-α-转化酶切割、被γ-促分泌酶切割，在被后者切割时，需早老蛋白的参与。最终能够释放Notch胞内区ICN，进入细胞核，以进一步发挥生物学作用。

Notch配体：又被称为DSL蛋白，胞外区域含有多个的EGF样重复区，N端有一个DSL基序，此基序为结合Notch体的位置[20]。

CSL：为转录因子，能识别DNA序列(GTGGGAA，位于Notch诱导基因的启动子上)，并进行结合。如ICN不存在，则CSL为转录抑制因子。CSL结合ICN，诱导基因表达。碱性螺旋-环-螺旋类转录因子(basic helix-loop-helix，bHLH)为Notch信号的靶基因，还可调节其他基因(细胞分化相关基因)的转录。

1.3 Notch信号通路在胰腺中的作用 在胰腺发育中，Notch信号通路十分重要，可以决定细胞分化的命运[21]。动物实验中，进行小鼠胚胎发育研究时发现：其胰腺特异分化大约开始于胚胎期第8.5天，在第13.5天则可分化为一种特定类型的胰腺细胞。Notch受体Notch1在第9.5天，则可检测到，到第14.5天表达开始下降[22]。有学者进行了如下动物(小鼠)实验：在胰腺发育中，抑制Notch信号通路，出现了胰腺发育不全的情况；如异常活化Notch1，在抑制其他分泌腺分化的情况下，绝大多数胰腺上皮细胞均具有原始转录因子的特性，证实：Notch信号通路在胰腺早期发育中，能够使胰腺上皮细胞维持祖细胞状态，延迟分化的作用。但对于Notch信号通路，在胚胎发育晚期及成熟组织中的作用尚不明确。如小鼠出现急性胰腺损伤，Notch信号通路被激活，腺泡细胞则会进行增生、去分化、再分化等过程。有国外学者在探讨急性胰腺炎的过程中，发现了Notch信号通路Notch1的高表达，修复期时Notch1、Notch2表达水平逐渐升高，在第3天达到顶峰后逐渐下降。Notch1在重症急性胰腺炎中的表达高于轻型急性胰腺炎，可通过Notch1的过表达，抑制胰腺细胞的凋亡，加重胰腺炎[23]。在动物实验中，如敲除Notch1基因，发现其修复功能明显受损，提示Notch途径能够在一定程度上利于胰腺损伤的修复[24]。有研究指出，肿瘤的发生，与胚胎发育完成后典型低表达的信号通路活化被错误的再激活有关[25]，而Notch信号通路在调节正常胰腺发育过程中，上皮前体细胞的分化中有着重要作用。Notch信号通路使细胞处于未分化、增殖状态，因此胰腺癌与Notch信号通路异常再活化的关系引起了很多学者的注意力。目前，通过查阅资料笔者发现，人们对于Notch1在胰腺癌中的研究较多，关于其他3种类型则较少。

2 Notch1在胰腺癌中的作用机制

Notch1信号通路在细胞增殖中有着重要作用，目前认为，Notch1受体是一种促癌因子，在胰腺癌细胞中，能够被异常激活，继而促进癌细胞增殖，参与到肿瘤侵袭、转移的过程中[26]。

2.1 Notch1表达与胰腺癌微血管、微淋巴管形成的关系 1971年，有学者提出肿瘤组织中血管生成由血管数目及结构决定，血管生成可促进肿瘤发展，是肿瘤的生长必要条件。另外，淋巴管是肿瘤细胞扩散至局部淋巴结的主要通路，一些研究发现，胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤等不同肿瘤组织中微淋巴管密度是无差异，但在肿瘤周围组织中的差异则较为明显，表明肿瘤组织中的微淋巴管绝大多数是无功能性的，但在其他癌症的研究中，认为淋巴管表达程度与临床分期、淋巴结浸润、淋巴结转移、肿瘤恶性程度、血行转移、复发和预后密切相关，但微淋巴管与胰腺肿瘤的关系是存在争议的。王红卫[27]的研究中收集了90例胰腺癌手术患者，进行人胰腺癌组织、癌旁组织配对，结果显示：与癌旁组织相比，胰腺癌组织中的Notch1蛋白及微血管表达水平较高，微淋巴管表达水平较低，且三者均是术后生存的危险因素，Notch1蛋白及微血管、微淋巴管表达水平与肿瘤分期呈正相关，这一结果证实，Notch1可促进胰腺癌组织的生长，这可能与微血管、微淋巴管形成有关。

2.2 Notch1表达与胰腺癌HPAC 细胞Notch信号通路下游Hes家族靶基因的影响 李炳秋等[28]在“Notch1和 Notch2对胰腺癌HPAC细胞中Hes家族靶基因的不同调控作用”中结果显示：HPAC 细胞中 Notch1 的靶基因是Hes1和Hes6，而Notch2的靶基因是Hes1，提示不同Notch家族成员调控的靶基因有交叉但是不同，直观的验证了Notch1和 Notch2在胰腺癌信号通路角度的不同作用，提示两者之间存在不同的生物学作用。

在朱雷等[29]学者的“Notch1在胰腺癌中的表达及临床病理学意义”研究中，探讨了胰腺导管腺癌中Notch1蛋白和mRNA表达水平及临床病理学意义，通过检测配对的癌组织及癌旁组织石蜡标本Notch1蛋白表达水平，观察其与患者的临床病理学参数的关系，同时检测3株分化程度不同的癌细胞系(PANC-1、BxPC-3和CANPAN-2)中mRNA的表达，结果证实，在胰腺导管腺癌中Notch1表达上调，且与肿瘤的分化程度相关。因此可将其作为胰腺导管腺癌患者预后的一个独立评估指标。但该实验并未通过体内或者体外实验进行进一步的深入研究，验证Notch1对胰腺癌的生物学功能的影响。

2.3 Notch1信号通路对胰腺癌细胞增殖、细胞周期及侵袭转移能力的影响 Notch1可促进癌症的进展这一结论的得出，还可从另外一方面进行验证：长链非编码RNA(long chain noncoding，IncRNA) ROR参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭迁移、血管形成等，在多种癌症(前列腺癌、乳腺癌、肝癌等)中表达水平高于正常组织，有明显的致癌作用，而通过质粒转染IncRNA ROR发现，其与Notch1的表达含量，无论是mRNA水平还是蛋白水平均呈正相关，在胰腺癌组织中，二者的表达含量呈现中等相关性。这一结果提示：Notch1可能是IncRNA ROR的下游靶点。李冰等[30]学者在“长链非编码RNA ROR通过notch1蛋白调控胰腺癌细胞的增殖凋亡”一文中，以胰腺癌细胞为研究对象，探讨ROR对Notch1的RNA水平，并了解 Notch1蛋白的变化，结果中显示：ROR与Notch1在胰腺癌组织中均高表达，且存在正相关的关系，癌细胞过表达长链非编码RNA ROR(IncRNA ROR)后，细胞增殖活性升高，DNA损伤阳性细胞比例降低，notch1的mRNA及蛋白水平升高，再一次证实了：IncRNA ROR可促进Notch1蛋白表达，调控癌细胞增殖凋亡。王红卫等[31]学者的研究中，对人胰腺癌细胞转染Notch1后细胞迁移及侵袭能力变化与骨架蛋白的相关性，结果显示：Notch1慢病毒干扰的细胞，具有较高的侵袭能力，表明Notch1能够明显提高侵袭力，这可能是通过加强细胞中微丝微管运动性来实现的。人胰腺癌细胞中Notch1蛋白高表达，可以增强细胞迁移、侵袭能力和细胞中Fascin和Factin蛋白含量。Fascin是一种细胞骨架蛋白，在细胞迁移、细胞黏附及细胞间信息交流过程中发挥重要作用；Factin是一种肌动蛋白，在维持细胞形态和空间结构的同时，还与细胞的生命活动息息相关。二者结合，在细胞外基质、某些细胞因子的调控下，增强细胞迁移、侵袭能力。文中结果显示，这一发现为胰腺癌的治疗提供了一个新的靶点，提供新细胞分子生物学基础。

2.4 Notch1信号通路可抑制细胞凋亡 细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程，有研究证实，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族可直接导致细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡机制网络中处于中心地位[32]。其中caspase3被认为是凋亡通路的关键蛋白酶，为凋亡通路中的主要效应分子，一旦被激活，则可促进细胞凋亡的发生，因而又称之为“死亡蛋白酶”。caspase3活化后发挥作用的机制主要为[33]：(1)酶解灭活凋亡抑制物；(2)酶解细胞外机制及骨架蛋白；(3)裂解DNA修复相关分子。杜潇等[34]学者在“激活Notch1信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响”中对细胞凋亡进行了研究，结果显示：与对照组相比，胰腺癌细胞株组的caspase3活性较低，说明：上调Notch信号表达后，可降低caspase3活性，进而抑制细胞凋亡。

2.5 Notch1蛋白与胰腺癌临床病理特征与预后的关系 在“Notch-1信号通路与胰腺癌吉西他滨化疗耐药及胰腺癌临床病理预后特征相关性的研究”中[35]，证实在胰腺癌中，Notch1蛋白呈高表达状态，有极大可能为促癌因子，分析其与病理特征的关系，认为其与是否远处转移有关，而在进行生存曲线分析是发现：Notch1表达水平、淋巴结转移、肿瘤分期及切缘受累均为影响因素，上述因素纳入多因素回归模型中，发现前三者均为预后的独立危险因素，这一结果证实了Notch1表达水平与胰腺癌患者的病理特征及预后有着密切的关系[36,37]。

3 总结及展望

胰腺癌具有较高的病死率，早期难以诊断，恶性程度高，预后差。据统计，胰腺癌的新发病例与死亡病例几乎对等。手术是惟一有效的治疗方法，但只有15%左右的患者可手术切除，且多数患者仍会复发。因此在术后实施有效的辅助治疗，已成为很多学者较为关注的问题。近年来研究发现，多种信号通路，包括Notch在内，均在胰腺癌的发生发展中起着重要的作用，根据其受体又分为1、2、3、4类型，其中Notch1受体在胰腺癌的发生发展中发挥着重要作用，因此认为调控Notch1受体可成为治疗胰腺癌的一种新的方法。基于此，本文就Notch1在胰腺癌中的作用进行总结分析。目前，学者对于Notch蛋白在胰腺癌中的应用研究仍存在一定的限制，诸如Notch2、3、4蛋白等方面，因此仍需在此方面进行努力，以便深入探讨Notch在胰腺癌中的应用，为胰腺癌的治疗提供一种新的思路。