禽源沙门氏菌净化检测技术研究进展

牛 琼 ，杨 斌 ，杨 溢 ，朱国强 *

（1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009）

沙门氏菌（Salmonella）是人类细菌性食源性疾病的主要来源之一，可引起胃肠炎和菌血症，也可导致临床并发症和死亡。美国疾病控制和预防中心（Centers for disease control and prevention，CDC）曾报道，仅在美国每年就发生约120 万例沙门氏菌病病例[1-2]。在人类感染沙门氏菌的病例中，有近75%的感染是由于食用受污染的猪肉、禽肉和牛肉等引起的[3]。禽源沙门氏菌主要包括禽伤寒沙门氏菌（Sal⁃monella Gallinarum）和鸡白痢沙门氏菌（Salmonella Pullorum），鸡白痢（Pullorum disease）是2 周龄～3 周龄以内幼雏由于感染鸡白痢沙门氏菌引起的急性、系统性、败血性传染病，幼雏感染后出现白色下痢、精神萎靡等症状，致死率极高[4]；鸡伤寒沙门氏菌引起的鸡伤寒（Fowl typhoid）通常是危害成年鸡的一种急性或慢性败血症，鸡与火鸡均可感染，致各种年龄鸡的败血性伤寒症，可蔓延至生殖器官，导致病原体垂直传播[5]。目前由于抗生素的耐药性问题和缺少有效疫苗[6-7]，考虑到垂直传播的特点，防控该病的根本措施只能通过扑杀净化手段，而净化的核心在于准确快速检出感染个体，因此快速可靠且适用于现场的检测技术是有效实施禽源沙门氏菌病净化的关键。本文对近年来禽源沙门氏菌流行现状、净化检测技术和综合防治措施进行了综述，以期为禽沙门氏菌病的净化提供参考。

1 鸡白痢/伤寒沙门氏菌净化现状

美国从1935 年开始实施国家家禽改良计划（Na⁃tional poultry improvement plan，NPIP），通过建立鸡白痢净化评估标准，明确净化标准程序和净化标准要求，对参加改良计划的种禽场、养殖场、孵化场等的鸡群必须检测，一般在开产前（16 周）采用快速全血平板凝集试验对鸡群进行现场筛查，阳性鸡的血清样本建议送到指定诊断实验室采用试管凝集试验复核验证，也要对感染鸡的组织器官进行细菌的分离鉴定[8-9]。目前，美国和英国分别通过NPIP 和家禽健康计划（Poultry health scheme）已在商品代鸡群中完成鸡白痢/伤寒沙门氏菌病的净化[5]。上述国家近些年仅有小农场养殖的鸡群中出现鸡白痢/伤寒感染的零星病例报道[10]。

在中国，禽源沙门氏菌仍是家禽中流行率较高的病原菌之一。Gong 等从2006 年～2012 年的流行病学调查发现鸡白痢沙门氏菌是沙门氏菌属最常见的血清型，占17.0%[11]。张倩在2011 年～2016 年间采用平板凝集法对我国19 个省、市、自治区共60 个祖代种鸡场超过40 000 份血清样本进行鸡白痢/伤寒抗体检测，结果显示各年度祖代种鸡场阳性率为17.65%～78.95%，在2011 年～2013 年和2015 年～2016年间阳性鸡场和阳性鸡比例均呈下降趋势，而2013年～2015 年阳性率却有所上升[12]。近年来，许多学者对各地的鸡白痢/伤寒沙门氏菌感染情况进行了调查和报道。薛俊龙等调查了2008 年～2009 年山西省37 554 份父母代种鸡和2 441 份商品蛋鸡样本，结果显示父母代种鸡的平均阳性率为2.6%，商品蛋鸡的阳性率为15%[13]。刘佳等在2017 年～2018 年调查了山东省潍坊地区11 410 份鸡血清样本，采用鸡白痢/伤寒平板凝集试验的检测结果显示肉种鸡的平均阳性率为7.08%，蛋种鸡和商品蛋鸡平均阳性率分别为10.91%和48.17%[14]。元振杰等调查了2015 年～2016 年西藏拉萨市部分鸡场采集的1 203 份样品，结果显示禽沙门氏菌的平均阳性率为48.96%等[15]。

我国在《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020 年）》中指出，在2020 年之前所有种鸡场沙门氏菌病要达到净化标准。鸡白痢沙门氏菌病净化标准中规定，祖代和曾祖代养殖场阳性率要低于0.2%，父母代养殖场阳性率要低于0.5%，目前全国范围内官方报道仅有北京峪口禽业、吉林德大等少数龙头养殖业通过了鸡白痢净化示范场或创建场的认证。就最近的流行病学调查结果显示，全国范围内虽然种鸡场的祖代和父母代种鸡的禽沙门氏菌抗体阳性率低于商品代鸡群，但是大部分种鸡场的禽沙门氏菌的感染率仍远高于净化标准，这一事实表明我国种鸡场禽源沙门氏菌病的净化仍是一项重要工作。

2 净化检测技术

近年来，种鸡场实施禽沙门氏菌病的净化技术和净化措施是防控该病的重要途径，为了从源头上降低禽业严重的经济损失，快速准确、成本低廉的检测技术就显得尤为重要。

2.1 传统分离鉴定方法目前，国际上用于检测沙门氏菌的标准方法主要有（Food and drug administra⁃tion，FDA）《FDA 分析手册（2003 年3 月）》介绍的沙门氏菌的检验方法《食品和动物饲料的微生物学沙门氏菌检测的水平位置检测法》（ISO6579: 2002）。我国现行的沙门氏菌检测的标准方法有《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》（GB 4789.4-2010）等[16]，这些检测方法都是对样品进行细菌的分离培养，并结合生化方法得出检测结果。传统细菌分离培养鉴定技术检测成本较低，在细菌分离和分型鉴定中起着重要的作用，是不可或缺的金标准检测技术。这些标准的细菌分离培养方法大多是利用木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（Xylose ly⁃sine deoxycholate agar，XLD）培养基和亚硫酸铋琼脂（Bismuth sulfite agar，BS）等选择鉴别培养基，分离鉴定沙门氏菌的标准操作程序大约需要4 d～7 d，培养方法繁琐，需要依赖手工操作和主观判断[17]，对一些生化特性相似的其它种属菌无法准确鉴别[18]。一些研究者也在传统分离培养的基础上进行了缩短细菌的培养时间等一系列优化。刘知奇等利用疏水网膜过滤浓缩样品中的细菌，提高菌体富集效率从而达到缩短检测时间的目的，检测时间缩短到3 d，操作步骤略为简化[19]。黄文宇等在传统检测方法上提出改进措施，利用沙门氏菌分解丙烯乙二醇产酸使中性红指示剂变红的生化特性，通过添加物质对选择培养基进行了优化，可同步实现沙门氏菌的分离与鉴定，缩短检测时间至2 d[20]。上述的研究虽然对传统分离鉴定方法进行了优化，缩短了检测时间、简化了检测程序，但仍存在培养程序繁琐，耗时费力，效率低下的弊端，难以适应禽源沙门氏菌病快速简便净化的要求。

2.2 免疫学检测方法在禽源沙门氏菌的检测方法中，以全血平板凝集试验为代表的经典凝集试验使在大规模鸡群中快速筛查鸡白痢/伤寒真正成为可能[21]，由于该方法的便捷性和实用性，具有无可比拟的优势，在美国国家家禽改良计划的鸡白痢/伤寒净化工作中发挥了重要作用[5]。凝集原理是细菌颗粒性诊断抗原在电解质存在且温度适宜的条件下，结合相应的血清抗体后，数分钟内出现凝集凝聚现象，仅通过肉眼就能观察和判定结果。早在20世纪30 年代科学家们就开发了检测鸡白痢/伤寒的标准试管凝集试验（Standard tube agglutination test，STAT）、快速血清凝集（Rapid serum agglutination test，RSA）试验和用于全血平板凝集试验的染色抗原等[22]，这些凝集试验为之后的禽沙门氏菌病的净化工作奠定了基础。凝集试验具有如下优点：操作简便、成本低廉且不需要额外设备，尤其不需要实验室检测设备就能完成检测。因此，该方法在国内禽沙门氏菌病的净化工作得以广泛应用，但在实际应用中出现了检测结果不可靠的报道[23]，有报道在鸡白痢/伤寒凝集试验阳性鸡的卵巢等器官中分离到诸如肠炎、海德堡、鼠伤寒等非鸡白痢/伤寒沙门氏菌，提示非鸡白痢/伤寒沙门氏菌感染可能会造成交叉反应[24]。此外，也有假阴性漏检的报道[17]。总之，以全血平板凝集试验为代表的经典凝集试验的重复性稳定性有待改进和进一步完善。本研究室也利用鸡白痢沙门氏菌分离株制备了染色凝集抗原，通过以D 群沙门氏菌ELISA 作为金标准方法与商品化凝集抗原比较，结果发现二者的检测结果总符合率仅为79.5%，而使用自制凝集抗原与ELISA 检测结果的总符合率为88%，且自制凝集抗原出现的阳性反应更快更强，更易于现场的结果判定[21]。

ELISA 检测法具有特异性强、灵敏性高等优点，已经在各种病原微生物的检测中广泛应用。最近研究表明，Ma 等选择沙门氏菌pagC 编码的外膜蛋白为沙门氏菌靶标建立了一种检测该外膜蛋白抗体的间接ELISA 法，其对87 份鸡白痢阳性血清样品的检出率为86.5%（84/87），对93 份沙门氏菌阴性血清样品的检出率为0（0/93），此外该方法与凝集试验检测252 份临床鸡血清检测结果的符合率为80.6%，显示了良好的特异性和灵敏度[25]。Li 等基于鸡白痢沙门氏菌一种特异性的免疫原IpaJ 蛋白，建立了检测IpaJ 蛋白抗体的间接ELISA 方法，400 ng/mL的包被抗原便能检测出血清中的抗体，是监测鸡白痢沙门氏菌感染的一种新方法[26]。虽然近年来开发了一系列ELISA 方法[27-28]，提高了检测通量，但ELISA 方法检测成本高，以BioChek 公司的商品化D群沙门氏菌检测试剂盒为例，一次检测单个样本的平均费用为5 元～10 元，且需要相应仪器，并不适合于大规模养殖现场应用。而且该方法以LPS 作为包被抗原，可能与肠杆菌科内不同种属细菌的LPS存在一定程度的交叉反应，对结果判定有一定的影响。

免疫层析技术（Immunochromatography assay，ICA）是一种结合了免疫技术和色谱层析技术的检测方法，刘志科等基于鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A（invA）建立了一种检测该菌抗体的免疫胶体金试纸条，195 份临床样本的阳性检出率为13.85%，与平板凝集试验的符合率为96.43%[29]。该方法操作简便快速省时，适合基层现场快速检测。随着检测方法的快速发展，为避免肉眼观察引起的误差，对免疫层析技术又进行了优化，免疫荧光层析法即是将免疫学检测方法与荧光标记技术相结合的快速检测方法[30]，Yeung 等首次以金纳米颗粒作为探针载体，利用16S rDNA 探针-金纳米颗粒建立了一种免疫层析方法，对已知样品检测的敏感性为100%，特异性为94.93%[31]。张捷等人采用低噪声激发式荧光染料标记沙门氏菌单克隆抗体，采用免疫层析技术，制备了靶向于沙门氏菌的免疫层析试纸条。该试纸条特异性强，灵敏度提高了约100 倍，其检测限可达到0.5×103cfu/mL，整个检测过程可在45 min 内完成[32]，相比传统的培养方法，免疫层析技术在时效性方面具有优势，是一种新型高效、即时快速的检测方法。

2.3 分子生物学技术近年来，聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种敏感性高和特异性强的高通量方法[33]。传统的PCR 方法是通过靶向单一的病原体特异性基因片段进行检测，如本研究室张江英等建立的靶向沙门氏菌I 型菌毛蛋白调控基因fimW 建立的PCR 检测方法[34]和Xu 等基于毒力相关基因IpaJ 建立了检测鸡白痢沙门氏菌的PCR 方法[35]。值得注意的是本研究室杨溢等发现鞭毛钩蛋白编码基因flgE 存在于所有沙门氏菌中（包括无鞭毛沙门氏菌，如鸡白痢和鸡伤寒沙门菌），且其同源性高达100%，基于此建立了一种靶向flgE基因的单一PCR方法（专利申请号：201911036658.7）。Xu 等首次使用新基因SPUL 2693 作为鸡白痢特异性诊断靶标，利用SPUL-2693 建立了一种特异性快速检测鸡白痢沙门氏菌的一步PCR 方法，灵敏度可达到2.143 pg/μL，且与传统的血清学分型方法的结果一致[36]。随着PCR 技术的不断发展，研究人员建立了许多靶向不同目的基因的多重PCR 检测方法，Kang等基于glgC 和speC 基因的多态性区域建立了检测鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的双重PCR 方法[37]，该方法经济简便高效。由于荧光定量PCR 方法比常规PCR 方法敏感性更高，研究者根据沙门氏菌的不同靶基因（如invA、fimY 等基因）建立了多种荧光定量PCR 方法检测沙门氏菌。张童利筛选到鸡白痢沙门氏菌基因组中特有的一段基因作为靶基因，建立了一种SYBR 荧光定量PCR 检测方法，该方法最低检测限为34 fg/μL，检测模拟样品时该方法与传统细菌分离培养方法的符合率高达97.2%，为禽沙门氏菌病提供了快速诊断的技术手段[38]。研究者还开发了许多有优异特异性和灵敏度的PCR 检测方法，如首次利用PCR-高分辨率熔解曲线（PCRHRM）技术区分鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和其它菌的研究。Ren 等人基于遗传标记rfbs 基因第237 和598 位的单核苷酸多态性，发明了一种单核苷酸多态性（SNP）PCR-HRM 用于检测鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌[39]。PCR 技术准确灵敏，但是对操作人员、仪器以及检测条件要求较高，因此无法在基层大面积推广使用。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是通过肉眼观察扩增产物焦磷酸镁白色沉淀或者绿色荧光的有无来判断靶基因是否存在，具有灵敏度高和特异性强、省时省力、成本低廉等优点，适合基层现场检测[40]。在传统的LAMP 方法的基础上，研究者对该检测方法进行了优化，Liu 等靶向invA 基因开发了一种将LAMP 与横向侧流试纸（LFD）相结合的检测沙门氏菌的新型方法。该方法检测鸡白痢沙门氏菌基因组的灵敏度可达89 fg/μL，是常规PCR 的1 000 倍，适合基层和现场检测[41]。LAMP 技术也有一些不容忽视的缺点，因其扩增产物通常要经凝胶电泳观察，这个过程容易产生气溶胶，污染实验环境并造成假阳性结果，且对操作环境和人员有较高的要求[42]。

2.4 其它技术生物传感器（Biosensor）作为一种检测手段已在食品安全检测中广泛应用，与传统的检测方法相比其具有分析速度快，灵敏度高，能满足现场检测的需求等优点。目前用于沙门氏菌检测的传感器包括酶传感器、免疫传感器、电化学生物传感器、基因传感器、光敏传感器等[43-45]。生物传感器虽然在沙门氏菌检测方面应用前景乐观，但传感器价格高，检测费用昂贵，限制了其在现场检测的广泛使用。

随着科技的发展，许多新方法也不断涌现，如石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance，QCM）[46]、夹心免疫分析方法（Sandwich immunoassay method）[47]和免疫荧光技术（Immunofluorescence test）[48]等，这些新方法各有优势，但这些检测方法离不开装备精良的实验室条件和训练有素的实验人员，大多无法满足禽源沙门氏菌现场检测需求。

3 净化检测的开展

3.1 净化检测时间的选取根据种鸡的饲养条件、日龄、血清抗体的消长规律，判定净化检测的最佳时间。动物检疫学研究表明，120 日龄～140 日龄的种鸡处于性成熟阶段，血清学检测方法反应速度快、检出率高，为首次沙门氏菌检疫的最佳时间。为进一步提高种鸡的净化质量，还必须进行第二次检疫，360 日龄～400 日龄的感染鸡的血清抗体趋于平衡状态，第二次检疫可把部分血清抗体阴性转阳性的鸡及时淘汰，此时则为第二次检疫的最佳时间[49]。

3.2 净化效果的评估规模化种禽场满足血清学抽检要求，即祖代以上种禽的沙门氏菌感染血清的阳性率低于0.2%，父母代种禽沙门氏菌感染的阳性率低于0.5%，连续两年以上无临床病例，即认为达到禽源沙门氏菌病净化状态。

3.3 净化后的综合防控建立生物安全综合防控体系来保障禽源沙门氏菌病的净化效果。种鸡场要定期开展灭鼠、灭蝇、灭蚊虫等工作，严格控制并最大程度降低生物媒介的传播风险。由于鱼粉中存在严重的沙门氏菌污染问题，因而饲料原料中杜绝使用鱼粉来减少病原菌的带入，生产的饲料成品避免被接触过鱼粉的人员、物品、设备所污染。饲料中可添加酸化剂或益生菌等，以最大程度降低沙门菌的感染风险；饮水中可持续添加氯制剂，避免通过饮水感染沙门氏菌[50-51]。

4 小结与展望

目前，禽沙门氏菌在我国各地的鸡群中有较高的流行率，提示基层禽沙门氏菌病的净化工作依然是任重道远。净化工作的成功开展核心在于检测技术，适用于禽沙门氏菌病净化工作的检测方法需要满足操作简便性、结果可靠性、价格低廉等条件。操作简便性是考虑到净化工作的效率和基层养殖场的人员、设备等条件限制，应避免过于复杂的操作程序，检测方法应该耗时短、易于掌握且不需要额外的设备为佳；结果可靠性是因为净化工作的有效开展关键在于检测方法的效果，结果可靠的检测方法可以避免漏检，减少检测重复次数，缩短净化周期，还可以避免淘汰假阳性鸡从而降低净化成本；价格低廉，则是考虑养殖企业的净化成本，由于净化工作开展过程中的检测样本众多，净化检测技术应避免过高的单个检测成本和依赖昂贵仪器。此外，净化状态的维持关键在于生物安全防控，只有有效的生物防控措施才能保障净化工作的顺利开展，才能避免病原菌的传入从而维持净化状态。狠抓种鸡的检疫净化工作，杜绝病原体传入养鸡场，严格执行各种鸡群的消毒措施，并通过科学的检测方法剔除带菌鸡，能够切实提高鸡沙门氏菌病的检疫净化效率和保障禽沙门氏菌净化状态的维持。

上述禽沙门氏菌的净化检测技术都是优点和缺点并存，一方面承担净化工作的单位可以根据实际情况选择或组合选用合适的检测技术，另一方面也显示出目前缺少一种同时满足操作简便性、结果可靠性、价格低廉等条件，适用于基层禽沙门氏菌病净化工作的检测方法。目前本研究室已经研发了一种可以避免非特异性反应的新颖检测系统，基于该系统可以实现采一滴全血即时（2 min 内）、快速，仅需裸眼观察即可判定结果，并形成了一套鸡白痢/鸡伤寒净化程序。在实验室前期充分验证确保惰性载体检测系统的优良检测性能后，目前已经定点推广到数家大型养殖企业应用于种鸡场鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌净化工作中，并取得较好的成绩。相信拥有核心检测技术的新型净化程序对养禽业的长足发展，禽蛋产品质量的安全保障，食品公共卫生和人类健康都有着十分重要的意义。