30种中草药对鲟鱼源海豚链球菌的体外抑菌作用

姚 丽，董春燕，陈江凤，黎 明，邵 俭，安 苗，王常安，王静波，程振涛，姜海波,6，文 明

( 1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2.高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211； 4.中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070； 5.北京市水产技术推广站，北京 100176； 6.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025 )

鲟鱼是现存起源最早的脊椎动物之一，隶属于硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、软骨硬鳞总目、鲟形目。在全球的鲟形目种类中，自然分布在我国境内的鲟鱼种类共2科3属8种，分别是新疆的西伯利亚鲟(Acipenserbaeri)、小体鲟(A.ruthenus)和裸腹鲟(A.nudiventris)，长江水系和珠江水系的中华鲟(A.sinensis)，黑龙江水系的施氏鲟(A.schrenckii)和达氏鳇(Husodauricus)，长江水系的达氏鲟(A.dabryanus)和白鲟(Psephurusgladius)[1]。鲟鱼是我国重要的冷水性经济鱼类，其肉质鲜美，营养丰富。近年来，随着养殖规模不断扩大，养殖产量迅猛增加，至2017年我国鲟鱼产量已达83 058 t[2]。然而，疾病频发却成为影响鲟鱼养殖业可持续发展的最重要因素之一，尤其以细菌性疾病的危害最为严重。目前已报道的能够诱发鲟鱼细菌性疾病的主要致病菌有嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[3-6]、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)[7-8]、停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)[9]和海豚链球菌(S.iniae)[10]等。海豚链球菌属芽孢杆菌纲、乳杆菌目、链球菌科、链球菌属，为革兰氏阳性菌，广泛分布于水环境、土壤和食物中。该菌感染宿主广、致病力强，给水产、禽类以及人类健康带来严重危害[11-12]。已有研究报道虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[13]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[12]、斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)[14]等养殖鱼类感染海豚链球菌，并导致严重经济损失。

使用化学消毒剂和抗生素类药物防治鱼类细菌性疾病是当前水产养殖生产过程中的主要手段。但是长期使用此类药物不仅破坏养殖水域环境，而且会导致病原菌产生耐药性、鱼体药物残留超标，进而影响水产品的食用安全性[15-17]。中草药具有来源广泛、毒副作用小、残留少、安全性高、无残留和疗效好等特点，因此利用中草药防治鱼类细菌性疾病备受关注[18-21]。现有研究表明，黄连、黄芩、大黄、黄柏、博落回、五倍子和石榴皮等中草药对罗非鱼源海豚链球菌具有较强的抑菌效果[22-24]，但针对鲟鱼源海豚链球菌尚未见报道。笔者选取黄连等30种中草药，研究其对鲟鱼源海豚链球菌的体外抑菌作用，以期为防治鲟鱼源海豚链球菌诱发的疾病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

海豚链球菌为北京市水产技术推广站分离鉴定和保存提供。

1.2 试验药物

选取黄芩、黄连、金银花、连翘、穿心莲、山楂、生首乌、秦皮、射干、女贞子、猪苓、苍术、苏叶、党参、茯苓、贯众、竹柴胡、凤尾草、薄荷、丹参、志远、苦楝皮、丁香、金樱子、石榴皮、野菊花、忍冬藤、青蒿、桔梗和使君子30种具有广谱抗菌及消炎功效的中草药为研究对象，试验前将30种中草药分别粉碎后过60目筛，干燥保存备用。

1.3 中草药药液制备

取上述30种中草药各20 g，分别注入300 mL双蒸水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火熬制30 min，4层纱布过滤，收集滤液，重复3次，合并3次滤液，浓缩至20 mL(即质量浓度1000 mg/mL)，经4000 r/min离心30 min后装瓶高压灭菌，放凉后置冰箱4 ℃保存备用[23]。

1.4 菌悬液的制备

取保藏菌种，接种血平板，28 ℃培养24 h。挑取单菌落于TSB液体试管中进行摇床培养24 h(28 ℃，140 r/min)，调整菌液密度为2×108～3×108cfu/mL，用于后续试验。

1.5 中草药平板抑菌试验

采用牛津杯法[23]，即在无菌条件下，用直径9 cm培养皿，将其平均分成3个区域，分别在固定位置放入高(10±0.1) mm、外径(8±0.1) mm、内径(6±0.1) mm的3只牛津杯内，并排列呈正三边形，保持相邻两孔的距离大于3 cm，以免相邻的抑菌圈重叠而影响测量准确性。待灭菌培养基冷却至50 ℃时倒平板(30 mL/个)，放出部分水汽，放平，待其凝固后用无菌镊子将牛津杯轻轻取出，留下3个大小一致的孔洞，并在底部的相应位置作好记号，在每个平皿内分别加入0.1 mL海豚链球菌菌液，用无菌玻璃涂布棒涂抹均匀，最后在孔洞里分别加入100 μL中草药药液，每个平皿中加1种药液，每种药液加3个平板孔作为平行样，设置阳性对照(涂菌，打孔，加强力霉素)和空白对照(涂菌，打孔，加双蒸馏水)，将平皿小心地平移至恒温培养箱中，28 ℃培养24 h，培养后分别观察并测量抑菌圈直径大小，每孔取不同方向测量2次，最终求取3个平板共6次测量结果的平均值，以代表该种药液抑菌效果[25-26]。判断标准：抑菌圈直径0～10 mm为低度敏感，10～20 mm为中度敏感，>20 mm为高度敏感[24,27]。

1.6 中草药最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度的测定

采用二倍稀释法[15,28]，测定30种中草药水溶性提取物的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度。具体操作如下：取13支灭菌带棉塞的试管(15×150)进行编号(1～13号)，首先在1～13号试管加入2.5 mL无菌液体培养基；其次在1号试管中加入2.5 mL原药液混匀，随后从1号中吸取2.5 mL加入2号试管，依次吸取2.5 mL混合液加入后面编号的各试管中直至11号试管，然后再从11号试管吸取2.5 mL丢弃；最后在1～11号试管中各加入100 μL菌液摇匀，12号试管加菌液不加药液作为生长对照，13号试管加药液不加菌液作空白对照。每种中草药重复3次，于28 ℃的振荡培养箱中培养24 h；培养结束后观察1～13号试管内的细菌生长情况，其中无菌生长的最高稀释质量浓度即为最小抑菌质量浓度。

在最小抑菌质量浓度试验基础上继续培养24 h，观察结果，清澈透明无混浊现象的试管即为无菌生长试管。无菌生长试管中的最低药物质量浓度为最小杀菌质量浓度。

1.7 数据处理

采用SPSS 16对所得数据进行统计分析，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 中草药水提物的抑菌圈结果

中草药提取物对致病菌海豚链球菌的抑菌直径见表1。结果显示，海豚链球菌对黄连、丁香、连翘和黄芩4种中草药高度敏感，抑菌圈直径依次为(28.35±0.65)、(23.63±3.38)、(23.53±1.93) mm和(22.96±2.01) mm；海豚链球菌对生首乌、猪苓、苍术、茯苓、贯众和丹参6种中草药低度敏感，其抑菌直径分别为(8.63±0.00)、(8.56±0.00)、(9.29±2.19)、(9.37±1.15)、(9.45±0.45) mm和(8.06±0.46) mm；海豚链球菌对剩余20种中草药中度敏感。

2.2 中草药的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度

30种中草药对海豚链球菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度结果见表2。黄连、黄芩、连翘和丁香4种高度敏感中草药提取液对病原菌的最小抑菌质量浓度分别为1.95、1.95、3.90 mg/mL和3.90 mg/mL，最小杀菌质量浓度分别为3.90、15.62、7.81 mg/mL和15.62 mg/mL。秦皮虽然属于中度敏感中草药，但是其最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均较低且相同，为7.81 mg/mL。其余19种中度敏感中草药最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均大于15.62 mg/mL。低度敏感中草药中仅贯众可获得最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度，分别为500 mg/mL和>500 mg/mL。

表1 30种中草药对海豚链球菌的体外抑菌圈Tab.1 Antibacterial effects of 30 Chinese herbal medicines against S. iniae in vitro

注：“R”.低度敏感(0～10 mm); “I”.中度敏感(10～20 mm); “S”.高度敏感(>20 mm).表中数值为n=6平均值.

Note:“R”.low sensitivity (0～10 mm); “I”.moderately sensitive (10～20 mm); “S”.highly sensitive (>20 mm). The value in the table is the mean value(n=6).

表2 30种中草药对海豚链球菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度 mg/mLTab.2 Minimal inhibitory concentrations (MIC) and minimal bactericidal concentrations (MBC) of Chinese herbal medicines against S. iniae

3 讨 论

3.1 中草药提取液的体外抑菌效果分析

本研究发现，鲟鱼源海豚链球菌对黄连、黄芩、连翘和丁香4种中草药水提取物高度敏感，其中黄连、黄芩的研究结果与针对罗非鱼源海豚链球菌的研究报道一致。张彬等[23]证实，罗非鱼源海豚链球菌对黄连和黄芩高度敏感。但张彬等[23]发现，罗非鱼源海豚链球菌对连翘仅仅表现为中度敏感，体外抑菌圈直径为(14.67±0.82) mm。在本研究中，连翘对鲟鱼源海豚链球菌体外抑菌圈直径达到(23.53±1.93) mm，表明鲟鱼源海豚链球菌对连翘水提物高度敏感。而吴颖瑞等[22]认为，罗非鱼源海豚链球菌对黄连低度敏感，而黄芩、连翘对罗非鱼海豚链球菌无抑菌效果。研究结果存在差异，这可能与供试菌株、供试药液制备方法、供试药液含量等方面不同有关。本研究中采取水煎煮法，配置的供试药液质量浓度为1000 mg/mL；张彬等[23]同样采取水煎煮法，但是配置的药液质量浓度仅为480 mg/mL；吴颖瑞等[22]则采用95%乙醇回流提取，制备成浸膏状，使用乙醇∶吐温∶蒸馏水=1∶1∶8(体积比)的混合溶剂，配置成质量浓度为1000 mg/mL的供试药液。目前提取中草药的方法分为传统提取方法(煎煮法、浸渍法、回流法、渗漉法等)和新型提取方法(超临界流体萃取法、酶法、半仿生—酶法等)。中草药成分复杂，采取不同提取方法对中草药有效成分的提取率不同，进而表现为药效不同[29]。

3.2 中草药的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度差异及成分分析

张彬等[23-24]报道，黄连提取液对罗非鱼源海豚链球菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度分别为3.75 mg/mL和7.50 mg/mL，这与本研究结果极为相似。本研究中，黄连提取液对鲟鱼源海豚链球菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度最小，分别为1.95 mg/mL和3.90 mg/mL，表现出很好的抑菌、杀菌效果。中草药的抑菌、杀菌效果与其含有的抗菌活性物质有关[30]。黄连中富含黄连碱、小檗碱、巴马汀等活性成分，通过破坏细菌结构、抑制糖代谢达到抑菌的作用[31]。林媛等[32]证实，小檗碱对痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等细菌均表现出很好的抑菌效果，最小抑菌质量浓度均小于100 μg/mL。本研究中，黄芩和连翘同样表现出较好的抑菌、杀菌效果，黄芩的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度分别为1.95 mg/mL和15.62 mg/mL，连翘的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度分别为3.90 mg/mL和7.81 mg/mL。同样，黄芩和连翘针对罗非鱼源海豚链球菌也表现出较好的抑菌、杀菌效果，张彬等[24]报道，黄芩和连翘提取液对罗非鱼源海豚链球菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度相同，分别为7.50 mg/mL和15.00 mg/mL。研究发现，黄芩中主要活性成分黄酮类化合物，可以通过阻碍细菌体内的能量代谢途径，实现广谱抗菌作用[33]。连翘中含有抗菌活性的苯乙醇苷类化合物：6′-O-(顺式-1，4-二羟基环己乙酰基)-类叶升麻苷(1)；4-O-鼠李糖基-7S，8R-7′，8′-赤式—蒜芥茄脂素(2)；毛花球花苷A(3)；黄花马缨丹苷 B(4)；石蚕苷B(5)；紫茎女贞苷J(6)；厚朴苷F(7)；松果菊苷(8)；异厚叶车前苷(9)。其中化合物1、6、8对金黄色葡萄球菌(ATCC 33591)生长具有中等强度抑制作用，最小抑菌质量浓度分别为8.00、16.00、4.00 μg/L，表现出消炎、抗病毒、抗氧化等多种药理学作用[34]，这些药理学作用与连翘的抗菌作用密切相关。目前尚未见关于丁香和秦皮对海豚链球菌抑菌、杀菌效果的报道。本研究发现，上述两种中草药水提物表现出与连翘相似的抑菌、杀菌效果，这同样与其含有的活性成分密切相关。付振喜[35]研究发现，丁香主要活性成分为丁香精油，具有广谱抗菌作用，其对青霉(Penicillium)、腐霉(Pythium)、交链孢(Alternaria)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度分别为3.125、1.56、6.25、6.25、3.125 μg/L，最小杀菌质量浓度分别为3.125、3.125、6.25、6.25、6.25 μg/L。现代药理学研究表明，秦皮具有抗病原微生物、抗炎等作用，姚丽芳等[36-37]报道，秦皮对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。翁远超等[38]分析获得，秦皮中主要已知化合物有16种，其中橄榄苦苷、plantainoside A、calceolariolside A、calceolariolside B和hydroxyframoside A对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有体外抑菌活性，且体外对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度分别为512、64、256、128、512 mg/L。此外，供试中草药的产地、药用部位、煎煮方法、采集季节、植物年龄、贮藏及炮制方法等因素也是影响中草药药效的重要因素[23]。

本研究证实，黄连、黄芩、连翘、丁香和秦皮对鲟鱼源海豚链球菌均具有较好的抑菌、杀菌功效，其中以黄连功效最佳。但其对病原菌的抑菌机理目前尚未明确，有待于进一步证实，同时其实际临床应用疗效有待于进一步通过动物体内试验加以比较、验证。