西洛他唑改善脑梗死急性期小鼠脑血流量作用机制研究

卢山 唐波 詹建伟 陈子晞 徐远胜 王芳 吴锦鸿

西洛他唑（cilostazol，CLZ）是一种磷酸二酯酶Ⅲ抑制剂，可通过抑制血管内环磷酸腺苷水平，起到抗血小板聚集作用[1]。已有证据表明，CLZ 可通过抑制细胞凋亡来保护血管内皮细胞，激活动脉平滑肌中钙离子通道来诱导血管舒张从而影响脑血流量[2-5]。另有文献报道长期持续口服CLZ 可改善脑梗死急性期后缺血半暗带区域的脑血流量[6-8]，但是CLZ 对于脑梗死急性期脑血流量改善效果及作用机制鲜有报道。本资料通过在日本学习期间进行了前期研究，即在构建小鼠脑梗死模型并使用CLZ 进行治疗后观测建模小鼠左侧大脑关注区域（region of interest，ROI）及对侧映射区域（以矢状缝为中线分隔的对侧镜像区域）的脑血流量值并进行对比分析，评估CLZ对于急性脑梗死后梗死区域脑血流量的改善效果；回国后进一步检测加入CLZ 培养的小鼠大脑由来血管内皮细胞的磷酸化内皮型一氧化氮合酶（phospho-endothelial nitric oxide synthase，p-eNOS）与内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）比值，评估CLZ是否具有促进eNOS 活化的效果。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 （1）实验动物：8 周龄雄性Icr 小鼠12只，体重18.0～23.0（20.0±3.0）g，由日本Clea Japan Inc公司提供，置于日本兵库医科大学动物房饲养，12h 明暗周期循环，控制室温为（21±2）℃。制备脑梗死模型后1 周内予以粉状饲料饲养。本实验取得日本兵库医科大学动物保护委员会批准。（2）实验离体细胞培养：CRL-2299 系列小鼠大脑由来血管内皮细胞由美国ATCC 公司提供。（3）药物：CLZ，产品批号：190106P，50mg/粒，由浙江大冢制药有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 为保证腹腔注射给药剂量的稳定性，将CLZ 粉碎后用羟乙基-β-环糊精（2-Hydroxypropylβ-cyclodextrin，HPβCD）制备成性质较稳定的悬浊液；为排除HPβCD 影响，使用磷酸缓冲盐溶液（PBS）作为溶剂制备PBS 悬浊液。

1.2.2 小鼠脑梗死模型建立、分组及给药 12 只小鼠均使用3%异氟烷诱导全身麻醉及1.5%异氟烷维持麻醉，以右侧卧位固定，暴露左侧颞部，消毒后于左耳外耳道至左眼连线中点处剪开皮肤，钝性分离静脉、唾液腺及肌肉，并电凝阻断手术视野内所见血管。分离相关组织至左侧颧骨颧弓区，剪断颧骨，继续分离肌肉及相关组织至颅底，在嗅索区域使用骨钻去除颅骨，分离已暴露的硬脑膜，充分暴露左侧大脑中动脉，在近嗅索区使用双极电凝器阻断左侧大脑中动脉，并用显微剪剪断已电凝阻断部位的残余血管以确保血管阻断。于手术区域加入动物用抗生素，将之前钝性分离的组织复位，缝合皮肤。术后将小鼠放入恒温箱内观察，待完全脱离麻醉状态后继续相关实验。手术过程中将小鼠体温控制于（37.0±0.2）℃。建模成功后，小鼠左侧大脑即出现局限于大脑皮层的脑梗死病灶。建模手术完成后30min，待脑梗死区域范围稳定后, 将其分为CLZ 组、PBS 组和HPβCD 组,每组4 只，分别腹腔注射50μl 的0.5%CLZ悬浊液，50μl PBS 及50μl HPβCD 溶液。

1.2.3 脑血流量测定及比较 本实验所行小鼠脑血流量测定及比较均在日本兵库医科大学先端医学研究所神经再生研究部门完成。使用日本Omegazone 公司OZ-2 的激光多普勒脑血流仪进行脑血流量测定[9]。以780nm 半导体激光光束测量左侧ROI（简称为L）及对侧映射区域（简称为R）的脑血流量，由仪器读取数值。L 测量区域设定为前囟左侧2mm 偏背侧1mm 范围，包括部分梗死区及部分缺血半暗带区域。于0min 及用药后10、20、30 及60min 测量脑梗死模型建立后及用药后L 及R 区域脑血流量，并比较上述各时点L 区域与R 区域的比值（L/R 比值）。脑血流量图像中暖色调区域表明脑血量增加值较高，冷色调区域表明脑血量增加值较低。

1.2.4 小鼠大脑由来血管内皮细包eNOS 含量测定 采用Western blot 检测。将CLZ（10μg/L）和等量HPβCD、PBS 分别加入培养液中对小鼠大脑由来血管内皮细胞进行培养，6d 后用10% SDS 凝胶电泳分离。采用英国Abcam 公司的eNOS 抗体测定eNOS 总量（t-eNOS），采用美国Cell Signaling Technology 公司的p-eNOS 抗体测量p-eNOS 抗体浓度，β-actin 含量作为检测样本含量参照。使用image J 软件，分析各组蛋白电泳条带teNOS、p-eNOS 及β-actin 的灰度值，在β-actin 灰度值进行统一化后换算，计算p-eNOS 与t-eNOS 灰度值比值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0 统计软件，符合正态分布的计量资料以比较，组间比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.13 组小鼠不同时间点的脑血流量图像比较 见图1（插页）。

由图1A 可见，CLZ 组小鼠在注射药物后半暗带区域脑血流量较其他两组小鼠有所增加，暖色调区域较其他两组面积大。由图1B 可见，ROI 区域脑血流量较对侧映射区域明显下降。

2.23 组小鼠不同时间点的L/R 比值比较 见表1。

由表1 可见，3 组小鼠在注射后10min 时L/R 比值，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。CLZ 组小鼠注射后20、30、60min 时的L/R 比值均高于PBS 组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。CLZ 组小鼠注射后20min、30min 时的L/R 比值高于HPβCD 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。CLZ 组小鼠注射后20、30 及60min 时的L/R 比值均高于注射前（0min），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表13 组小鼠不同时间点的L/R 比值比较

2.3 小鼠大脑由来血管内皮细胞的p-eNOS 及t-eNOS 含量比较 见图2。

图2 小鼠大脑由来血管内皮细胞p-eNOS 及t-eNOS 含量比较（a：3 组小鼠大脑由来血管内皮细胞的p-eNOS 及t-eNOS 电泳图；b：3 组小鼠大脑由来血管内皮细胞p-eNOS 与t-eNOS 灰度值比值比较）

由图2 可见，加入CLZ 培养6d 后的小鼠大脑由来血管内皮细胞内p-eNOS 与t-eNOS 比值（0.673±0.074）大于PBS 组（0.425±0.093）和HPβCD 组（0.438±0.062），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨论

CLZ 已在临床用于脑梗死二级预防[10]。CLZ 为非水溶性物质，本实验选用腹腔注射法以保证给药剂量恒定性，因此本研究使用将CLZ 纳米颗粒加入HPβCD 中制备悬浊液[11]，并使用CLZ 悬浊液进行腹腔注射给药。

本研究通过脑血流量测定发现，CLZ 组小鼠ROI区域及对侧映射区域脑血流量比值在注射后20～30min 时较注射前有明显增加，而CLZ 组、100μl CLZ、PBS 组及HPβCD 组相关脑血流量比值在注射后无明显改变。ROI 为脑梗死模型建模侧区域，其对侧映射区域为建模小鼠无脑梗死发生大脑半球区域，L/R 比值增加可以认为是在CLZ 给药后，ROI 脑血流量较对侧映射区域脑血流量有更强的改善效果，因此可以认为在Icr 小鼠脑梗死急性期使用适量CLZ 进行治疗，可显著增加半暗带区域脑血流量。这与既往相关研究报道CLZ 可改善机体组织缺血区域血流量[12-13]，减少缺血后的组织损伤结论相符[14-15]。

通过免疫印迹试验检测发现，在样本量相同的情况下，添加CLZ 培养的小鼠大脑由来血管内皮细胞内的p-eNOS 与t-eNOS 比值表达较PBS 组、HPβCD 组有明显增加。因此我们认为，CLZ 可能是通过调节脑梗死区域p-eNOS 活性，使脑梗死区域内一氧化氮浓度增加，促进局部血管扩张，最终达到改善脑梗死区域脑血流量的目的。这与相关报道的eNOS 具备促进组织产生一氧化氮达到血管扩张效果结论相符[7，14]。

本研究所选用的L-MCAO 模型为局部微创手术。具备制备简便，术后小鼠死亡率极低，长期存活率高，脑梗死模型病灶范围、体积占病变侧大脑总体积比例恒定等特点[5，9，15]。

本研究认为，CLZ 可通过激活eNOS 有效活性成分途径，达到改善脑梗死局部区域脑血流量效果，但尚未检测ROI 区域微小血管是否有增生，且未对CLZ 是否具有促进小鼠大脑由来血管内皮细胞增殖能力进行评估。已有相关报道CLZ 可能通过上调血管紧张素Ⅱ及血管内皮生长因子等途径促血管生成因子的表达进而促进缺血区域血管新生[16-18]，相较于阿司匹林有改善血管相关细胞功能减少脑出血的能力[19-20]。eNOS 也可能具备促进微血管新生[21]以及改善内源性神经细胞功能的作用[22]，后续也将对CLZ 是否具有促进小鼠大脑缺血区域血管新生能力以及改善大脑缺血区域内的血管内皮细胞、神经细胞活性能力继续进行探讨。

综上所述，CLZ 在脑梗死急性期可以通过激活eNOS 活性成分途径，起到改善脑梗死区域脑血流量效果,为脑梗死后缺血区域受损组织修复提供必要条件。