浓香型大曲白酒窖泥微生物研究进展

江 鹏，何朝玖，刘燕梅，尚娟芳，兰小艳，肖龙泉

（1.宜宾职业技术学院 五粮液技术学院，四川 宜宾 644003；2.宜宾市六尺巷酒业有限公司，四川 宜宾 644000；3.宜宾市产品质量监督检验所，四川 宜宾 644002；4.成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都 610106）

白酒是世界六大蒸馏名酒之一，由于白酒的酿造工艺不同和地理环境的差异，形成了多种香型的白酒，其中以浓香型白酒的产量和销量最大。浓香型白酒以粮谷为主要原料，以中高温大曲为糖化发酵剂，采用泥窖固态法发酵，经蒸馏，陈酿，勾兑而成，以己酸乙酯为主体香。浓香型大曲白酒生产的一个重要特征就是泥窖固态发酵，这就使得浓香型白酒对窖池依赖程度较大，然而窖池的功能载体是窖泥，窖泥中微生物的优劣对浓香型白酒生产至关重要。优质老窖才能生产好酒[1-3]，长时间的驯化与选择，孕育了窖池中独特的窖泥微生物群落。它们既相互共生，又相互竞争，通过复杂的相互作用关系，形成了一个稳定的生态系统。窖泥是白酒固体发酵过程中微生物的重要来源，是影响白酒的口感与品质的重要因素。因此，对窖泥中微生物的研究具有十分积极的意义和深远的影响。本文将对浓香型窖泥微生物研究中常用的技术方法进行介绍，并综述浓香型窖泥微生物研究进展，以期为窖泥生产和养护提供理论参考。

1 窖泥的概述

浓香型白酒是一类以泥窖固态发酵生产的白酒，泥窖尤其是人工泥窖大多采用黄黏土筑窖。白酒工作者对浓香型白酒生产实践经验的高度凝练和总结——千年窖池万年糟，窖池越老酒越香。在一定范围内窖泥的质量与浓香型大曲酒的质量存在一定关系，即窖泥越老，大曲酒的质量越高。窖泥中的主要功能微生物是在长期的发酵过程中筛选出来的，它们的群落结构对浓香型白酒的香味有较大的影响。窖泥微生物之间存在共生、互生及竞争等多种种群关系，长期的白酒生产使窖泥微生物的种类逐渐稳定[4]，同时产香味物质的功能微生物数量也呈上升趋势。目前研究发现新窖泥以乳杆菌为主，而老窖泥以梭菌纲、拟杆菌纲和产甲烷菌纲为主[5]。

2 窖泥微生物的研究技术

以往关于窖泥微生物的研究多基于纯培养的方式，从可培养的角度研究微生物群落和动态变化，分离和鉴定新型窖泥微生物，为浓香型白酒功能菌的筛选及菌种库的建立提供依据。随着微生物生态学的发展，分子生物学等先进技术越来越多地应用于窖泥微生物鉴定、群落组成解析等研究，使得对窖泥微生物认识越来越深入。

2.1 传统窖泥微生物研究技术

传统窖泥微生物研究方法是平板分离纯化及鉴定技术，该鉴定技术包括传统的菌落形态、生理生化以及对核酸序列对微生物分类。然而窖泥中能够采用平板分离培养的微生物仅占窖泥微生物的一部分。目前运用传统平板仅能分离得到可培养的微生物，对窖泥微生物的深入研究的意义不大。已证明表现型相同的微生物可能是一群有相同的生理特征或形态特征的微生物，这样是不足以明确分类的[6]。虽然传统窖泥微生物研究技术对窖泥微生物的研究存在不足，但厌氧培养、纯培养技术和传统的微生物鉴定技术为白酒生产起到了重要的推动作用[7-8]。黄治国等[9]从浓香型窖泥中分离纯化得到5株细菌，并用传统微生物鉴定系统鉴定了其中一株细菌。刘燕梅等[10-11]应用传统微生物分离方法从浓香型窖泥中分离研究了窖泥微生物的生理特性。雷光电等[12]通过对泸州老窖酒厂不同窖龄窖泥中5大功能菌群的数量和生态结构研究，发现窖泥功能微生物的数量随窖龄增加而增加。以纯培养方法对窖泥中的微生物研究由来已久。传统纯培养技术在窖泥研究中仍被广泛使用，这主要是由于该技术可以研究特定微生物的理化特征，分离得到的功能微生物可应用于白酒生产。

2.2 现代窖泥微生物研究技术

随着微生物研究技术的发展，分子生物学技术越来越多地应用于窖泥微生物鉴定、群落组成解析等研究[13]。现代分子生物技术具有不需培养、快速准确、灵敏度高等特点，对窖泥微生物的研究更加深入，现代分子生物技术可将窖泥微生物在种属水平上进行系统分析，对窖泥的实际生产和养护不仅可以提供理论指导，还能解决窖泥退化和老化问题。

2.2.1 磷脂脂肪酸指纹图谱技术在窖泥微生物研究中的应用

磷脂是大多数微生物（古生菌除外）细胞膜中相对稳定的成分，且含量相对比较稳定，只有微生物死亡后，磷酯类化合物才会迅速分解[14]。不同种类的微生物细胞膜上的磷脂脂肪酸组成及含量存在显著差异，即特定的特征脂肪酸仅存在特定的微生物中[15]。如：脂肪酸15∶0，a15∶0，i15∶0，10Me18∶0 等用来表征放线菌[16-18]。磷脂脂肪酸技术不需要酸15∶0，17∶0，18∶1ω7 等用来表征细菌；脂肪酸16∶0，18∶2ω6等用来表征真菌；不分离培养即可获得微生物群落信息，适合微生物群落的研究。该技术主要是提取脂肪酸结合常见微生物的磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）谱图数据库和利用气相色谱即可完成对微生物的鉴定，操作简便、结果较为可靠，能定量描述环境样品中的微生物群体[19-21]。近年来，磷脂脂肪酸技术在窖泥微生物的研究中得到广泛应用。PLFA指纹图谱技术分析法可简单归纳为：（1）提取磷脂脂肪酸；（2）气相色谱分析，获得PLFA谱图；（3）通过谱图的变化得到微生物结构变化情况。ZHAO J S等[22-23]采用磷脂脂肪酸指纹图谱技术对窖泥微生物进行了研究，结果表明厌氧细菌和真菌是窖泥中的优势菌群。李永博等[24]采用磷脂脂肪酸指纹图谱技术研究30年、100年的窖泥发现，100年窖龄的窖泥微生物比30年窖龄的丰富，细菌是窖泥的优势菌群。

2.2.2 克隆文库技术在在窖泥微生物研究中的应用

克隆文库是通过获得窖泥样品总脱氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA），以提取到的总DNA为模板聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增微生物的16S rDNA基因，然后将得到的扩增产物与载体连接，转化感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行测序，根据测序结果判断样品中的微生物信息，由于克隆文库针对原核微生物的16S rDNA全长，且避开了传统的纯培养方法，能将一些对营养要求苛刻的微生物鉴定出来，因此能更全面的反映样品中的微生物多样性；由于采用该方法能获取微生物的16S rDNA全序列，所以结果也更加准确。王明跃等[25-26]以克隆文库技术对不同窖龄窖泥古菌进行研究，研究结果表明，通过16S rDNA克隆文库技术能够系统地认识了不同窖龄窖泥细菌群落的基本构成及演替规律。窖泥微生物在50年前后变化明显，50年之前窖泥中古菌种群结构变化较大；50年之后，古菌群落结构趋于稳定。叶光斌等[27]以克隆文库技术对泸州地区浓香型窖泥原核微生物群落结构进行研究，研究结果表明，梭菌纲为窖泥内细菌群落的绝对优势种群，除此之外还存在一定比例的芽孢杆菌纲、拟杆菌门、柔膜菌门和互养菌门的分布。此外该研究还首次发现在泸州老窖窖泥内可能存在与甲烷菌共生的严格厌氧的梭菌纲类群的存在。尽管通过克隆文库法对窖泥的研究取得了一些成果，但该技术仍有不足，如操作繁琐，且耗时耗力等。

2.2.3 PCR-DGGE技术在窖泥微生物研究中的应用

变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术最初用于检测DNA中的点突变，后来逐渐用于环境微生物多样性的分析，如活性污泥、海洋、土壤等方面的微生物群落研究[28]。温度、pH等外界因素可以使DNA分子由双链变性为单链。聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术原理是利用不同DNA分子解链难易程度以及在聚丙烯酰胺电泳中迁移受分子质量和电荷的影响程度不同而实现分离[29]。该技术无需培养、直接提取总DNA分析的微生物多样性具有简便快速、结果准确，在白酒微生物的研究中起着重要作用。黄志国等[30-31]采用PCRDGGE技术及测序技术研究了不同窖泥细菌群落结构及多样性变化趋势，结果发现窖龄越长，细菌群落结构越稳定。钟姝霞等[32]通过PCR-DGGE技术研究了不同窖龄窖泥中主要微生物群落结构与窖泥理化指标之间的关系，研究结果表明窖泥的理化指标和微生物群落结构变化有极大相关性。卢振等[33]应用PCR-DGGE技术分析了不同性状窖泥的细菌群落，结果表明，窖泥中优势微生物包含拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和厚壁菌门4个门类，其中新窖泥中微生物最丰富，涵盖上述门类，假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌科（Enterobacterale），里氏杆菌属（Riemerella）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）为新窖泥特有的优势微生物。虽然PCR-DGGE具有免培养，检测快速、准确等优势，是白酒窖泥微生物群落结构的主要研究方法之一，但对一些数量低的窖泥微生物不能有效地检测出[34]。由于PCR-DGGE技术的优势明显，在白酒窖泥微生物群落的研究中有着重要影响，随着技术的发展，PCR-DGGE技术会不断优化，与其他现代生物技术结合，揭示窖泥微生物的“秘密”。

2.2.4 高通量测序技术在窖泥微生物研究中的应用

DNA测序是指测定组成DNA分子的核苷酸的排列顺序[35]。传统的测序方法是采用Sanger发明的末端宗旨测序法[36]，也称第一代测序法。该测序方法操作费力，且通量低、成本高，于是科学家们开发的二代测序技术，也叫高通量测序技术。该技术对微生物群落结构明显优势，能全面客观地揭示目标环境中微生物群落信息，同时获得定性及相对定量信息等优势[37]。现已被广泛的应用于窖泥及其他样品中微生物的多样性研究。赵东等[38]利用高通量测序技术解析五粮液窖泥原核微生物的群落结构，研究结果表明五粮液窖泥与其他区域的浓香型窖泥微生物群落结构存在显著差异。罗雯等[39]采用高通量测序技术对不同性状窖泥微生物组成研究，结果表明新窖泥、趋老化泥及老化窖泥中微生物分布特征较为相似，老窖泥与趋于老熟窖泥的微生物群落结构一致。刘博等[40]基于高通量测序技术解析浓香型白酒中窖泥臭味物质4-甲基苯酚的来源，研究表明4-甲基苯酚来源的主要微生物是梭状杆菌（Clostridium）。栗连会等[41]采用16S rRNA基因的高同量测序技术比较了窖泥中乳酸菌群落结构，研究表明发酵过程酒醅中存在49种乳酸菌，其中16种来源于大曲，3种来源于窖泥。邓杰等[42]采用高通量测序技术对浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥中古菌群落结构分析，研究发现窖泥古菌多样性与窖龄呈负相关。

2.2.5 宏基因组技术在窖泥微生物研究中的应用

宏基因组学技术（又称微生物原基因组技术）是利用现代基因组技术直接以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，分析微生物多样性、种群结构以及进化关系的现代分子生物技术[43-46]。仅靠传统培养法和传统分子生物技术很难研究清楚窖泥微生物以及窖泥微生物之间的相互关系[47]，大多数窖泥微生物是不能单独分离培养的，宏基因组技术测序周期短、测序通量大、灵敏度高，能对样品中总的微生物群落结构进行功能及代谢通路的分析[48]。

浓香型大曲白酒的发酵方式是泥窖固态发酵，在窖泥中存在着大量难以分离培养的窖泥微生物，他们的发酵机制及种群关系研究还不够深入，因而对窖泥微生物尤其是发酵机制和种群关系的研究具有重要意义。而宏基因组技术不需要对菌株进行分离而直接就可以研究窖泥微生物。徐资静等[49]利用宏基因组学技术研究剑南春糟醅细菌多样性特征，研究发现细菌种类和数量与糟醅层数有关，糟醅层从上到下，微生物的数量和种类逐渐减少。

3 结论与展望

在浓香型大曲白酒固态发酵过程中逐渐形成了复杂的窖泥微生物群落，微生物菌群相互作用和独特的生产工艺形成了浓香型大曲白酒窖香浓郁、绵甜爽烈的风格特征。由于窖泥中的酿酒微生物群落结构的复杂性，以及部分微生物难于分离培养，使得对窖泥微生物的研究提出了更高的要求。近年来，随着现代分子生物技术在窖泥中的应用，对窖泥微生物的研究越来越深入。主要集中在窖泥微生物群落多样性和窖泥微生物群落的演替及窖泥微生物群落结构与窖泥质量关系等方面的研究[49-51]。运用现代化的仪器设备和现代分子生物技术（克隆文库、DGGE、测序技术等）揭开了窖泥微生物的部分面纱：窖泥中的微生物种类与窖泥的质量关系极大，老熟窖泥中的优势微生物有拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和厚壁菌门等4个门类，其中放线菌可以作为一种判断窖泥老熟与老化的指示菌[44]。虽然现代分子生物技术已大量应用于窖泥微生物的研究，但是传统微生物学技术对窖泥微生物的研究仍占有重要的地位。总之，要完全认识窖泥微生物还存在较多技术瓶颈和壁垒。为进一步掌握白酒窖泥微生物与窖泥质量以及在代谢上的关系，宏基因组学、微生物代谢组学等现代分子生物技术将有助于加深对窖泥微生物代谢活动的认识和了解窖泥微生物群落代谢机制，有助于解决白酒生产中遇到的实际问题，以便生产更多优质的浓香型大曲白酒。