不同均质次数SPI-维生素D3纳米粒子结构与性质研究

王喜波 陈 爽 孙立娜 江连洲

(东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030)

0 引言

维生素D是人体必需的微量营养素，具有促进细胞生长、分化和对钙、磷的吸收等重要作用，还与某些肿瘤、自身免疫性疾病等有关[1-2]。维生素D3是维生素D的7-位脱氢胆固醇(7-dehydroch-olesterol, pro-vitamin D)的一种结构形态，在人体内经不同羟基化后，代谢为1,25-二羟胆钙化醇(维生素D3的生物活性形式)。维生素D是人体最易缺乏的维生素之一，且这种现象在全球范围内普遍存在[3-4]。维生素D3水溶性差[5]，对光照敏感，氧、酸性条件，脂肪酸败等都影响其稳定性，因此，维生素D3的利用受到限制。

大豆分离蛋白(Soy protein isolate，SPI)可以用作生物活性成分的输送载体，但由于SPI的疏水基团绝大部分深埋在内部，且结构较紧密，所以与生物活性成分小分子的结合能力有限。文献[6]研究发现，乳清蛋白的三级结构在适度加热的条件下发生改变，结构更加延展，增强了与小分子物质间的相互作用。文献[7]用超声制备了粒径分布窄小、具有缓释功能的酪蛋白-β-胡萝卜素纳米颗粒，有效提高了β-胡萝卜素的稳定性。高压均质技术在食品、医药和化妆品等领域已被广泛应用[8]，适当的高压均质处理能显著改善球蛋白的表面疏水性、溶解性、乳化性、柔性及抗氧化性等加工特性[9-11]。在食品行业，高压均质主要应用于乳液制备方面，如文献[12]采用高压均质制备乳清蛋白乳液，发现高压处理可以改变蛋白界面层的结构，同时改变乳液粒径，增强蛋白质在界面上的吸附性和蛋白质在界面上的相互作用效果，从而有助于形成比较紧密的界面层和稳定性强的乳状液。但采用高压均质制备SPI-维生素D3纳米粒子的研究却鲜有报道，本文研究高压均质次数对SPI-维生素D3纳米粒子结构及性质的影响，以期为开发高活性维生素D3产品提供技术和理论支持。

3.5 病虫害发生情况 避雨栽培的无核红宝石10月25日叶片仍然完好，而露地栽培的叶缘已经干枯卷曲。采用避雨栽培后，病虫害种类发生变化（见表4），灰霉病、霜霉病、黑痘病基本不发生，主要病害危害程度和鸟害危害程度都比露地栽培显著减轻。避雨栽培后，喷药次数比露地减少5次，大大减小了病虫害防控压力。避雨栽培后，裂果较露地有明显减少，仅避雨一项措施，就可以将裂果率降到3%以下，如果再结合地膜覆盖，避雨栽培就可以解决葡萄裂果问题。

总之，小说教学是语文阅读教学中的重要环节，是提高学生对文学的认识、增强对语文学习兴趣的重要基础。因此，教师要努力改变现在小说教学的尴尬境地，努力研究，采取各种方法，提高语文小说课堂教学的有效性。

老巴慌成一团。他急不择路地冲过去，蹲下身来扶老婆。慌乱中自己凭着一条腿怎么都站不起身。手臂下老婆的气息越来越弱。老巴慌了，声嘶力竭地叫唤，有如荒野中绝望的狼。隔壁左右听到这声音，吓得不轻，都急急奔来。

1 材料与方法

1.1 材料试剂与仪器设备

维生素D3，纯度99%以上，购自Sigma-Aldrich官网。低温脱脂豆粕，购自山东禹王实业有限公司。甲醇，上海安谱试验科技股份有限公司；1-苯胺基-8萘磺酸盐(ANS)，天津北科化学品有限责任公司；试验中所用试剂均为分析纯。

AVP-2000型高压均质机，英国Stansted Fluid Power公司；79-1型磁力加热搅拌器，金坛市双捷试验仪器厂；FTIR-8400S型傅里叶变换红外光谱仪，日本岛津公司；Mastersizer 2000型激光粒径分析仪，英国Malvern公司；U3000型高效液相色谱仪，美国Thermo公司。

1.2 试验方法

4） 在工程应用中，由于矿化垃圾反应床露天作业、占地面积较大，且矿化垃圾本身又是很好的植物培养土，因此可以考虑在矿化床表面种植绿色植物，并引入蚯蚓、屎壳郎等动物，提高床体表面的复氧能力，通过日益完善的微生物、植物、动物复合生态系统，进一步提高对尾水的处理效果。

在燕园上班，给我带来了很多的便利：第一，我每天上下班不用挤公共汽车，免除了途中劳顿；第二，我能领取一份稳定的薪水，解决生存没有问题；第三，我可以利用北大资源好好学习，全面提高自己的学养。

为避免维生素D3降解，以下操作均在避光条件下进行。称取一定维生素D3粉末溶于无水乙醇，并磁力搅拌以保证其完全溶于乙醇，置于棕色瓶中备用。每次试验前需重新配制维生素D3溶液。

将文献[13]描述的方法略做改动制备SPI，将SPI粉末溶于磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH值7.0)配制成4 mg/mL的SPI溶液，按照SPI与维生素D3质量比10∶1将维生素D3溶液加入到SPI溶液中，室温(20℃)下避光磁力搅拌1 h以制备SPI-维生素D3复合体系，在100 MPa下均质1～4次，得到不同均质次数的SPI-维生素D3纳米复合物。

1.2.2粒径和ζ-电位测定

用0.01 mol/L pH值7.0磷酸盐缓冲液将制备的不同均质次数的纳米复合物稀释至蛋白质量浓度为1 mg/mL，用Mastersizer 2000型纳米粒径仪检测纳米颗粒的粒径、多分散性指数和ζ-电位，测定温度为25℃，样品平衡时间为2 min。

m1——加入维生素D3的质量，mg

准确称取维生素D3标准品50 mg溶于甲醇并定容至50 mL，配制成1 mg/mL的维生素D3甲醇溶液，再用甲醇将其分别稀释至质量浓度为0.5、0.25、0.01、0.001 mg/mL的标液，将各质量浓度的标液过0.22 μm有机系滤膜，采用高效液相色谱进样分析，以各标液的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。高效液相色谱分析参数参照文献[14]的方法，高效液相色谱检测器为紫外检测器，波长为265 nm，所用色谱柱为C18液相柱，检测时，柱温为25℃，流动相为甲醇(100%)，流速为1 mL/min。

1.2.4维生素D3包封率和负载率测定

包封率和负载率的测定参照文献[15]的方法并略做改动。将10 mg冻干样品用5 mL甲醇进行淋洗，然后用Whatman No 1型滤纸过滤，重复2～4次，将滤液合并，然后将滤液过0.22 μm有机系滤膜后用高效液相色谱测定其中维生素D3含量(未结合维生素D3含量)，将过滤后的粉末冻干并称量。样品包封率和负载率计算公式为

内源荧光光谱测定参照文献[17]的方法，并略做改动，将各样品分别稀释至蛋白质量浓度0.5 mg/mL，设定激发波长为290 nm，发射波长范围为300～400 nm，狭缝宽度为2.5 nm，电压700 mV，进行内源荧光光谱扫描。

(1)

(2)

式中E——包封率，%

L——负载率，%

虽然污水处理过程中的回流污泥泵正常运行，并且上清液也能够全部回流，出水氨氮达标，但是总氮依然超标。因此，可以将缺氧搅拌全部设定为反硝化，这样能够很好地进行脱氮，并控制好出水总氮量，达到相关标准的要求。

1.2.3维生素D3标准曲线绘制

从业人员整体素质偏低，缺少优秀专业人员，是行业内的一大问题。在如今阶段，除了央视广播电视频道能够做到对信息的实时更新和传播，大多数地方广播电视台受到节目播出时间、技术落后等各种因素影响，大部分新闻、资讯播出具有延时性。这样就非常容易造成在信息反馈给大众时，发现新闻播出，但是信息已发生变化的现象，这就使新闻报道失去了真正的意义。

宽甸县年最低气温整体呈周期性变化，如图3所示。2000、2001年为偏冷期；最高值出现在1995年，为-21.7℃，最低值出现在2001年，为-33.5℃，两者相差11.8℃。2014—2017年为偏暖期。

m2——未与SPI结合的维生素D3质量，mg

m3——SPI质量，mg

1.2.1SPI-维生素D3纳米复合物制备

制造能力是面向云制造的一种重要资源，体现在具体活动过程中，反映了制造企业或制造实体在制造全生命周期过程中完成某一任务的能力[8]。针对制造过程的可持续制造能力，Zhao等[9]建立了针对工业机器人的可持续制造能力动态模型；Luo等[10]提出了针对云制造系统的制造能力多维信息的建模与描述方法；Xu等[11]对制造设备能力相关的信息进行了动态建模；Kulvatunyou等[12]提出一种体现供应商制造服务能力的信息模型，并利用基于本体的Web语言提高模型敏捷度。

1.2.8傅里叶红外光谱分析

参照文献[14]的方法并稍做修改，将各样品在紫外-可见分光光度计600 nm波长下测定其吸光度，所得OD值用来表示浊度，用去离子水作为空白。

1.2.6表面疏水性测定

参照文献[16]的方法，并略做改动。用磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH值7.0)将样品溶液稀释到1、0.2、0.04、0.008 mg/mL，然后加入20 μL的ANS(8 mmol/L，溶于0.01 mol/L的磷酸缓冲液，pH值7.0)荧光探针，混合均匀后在室温下进行避光处理，15 min后测定各样品的荧光强度，设定激发波长为390 nm，发射波长为470 nm，狭缝宽度5 nm，以测得荧光强度为纵坐标，以蛋白溶液质量浓度为横坐标，选择线性关系良好的回归线的斜率作为蛋白质表面疏水性指数。

1.2.7内源荧光光谱测定

还有“名著管理法”。每学期初，我要求学生每人至少准备一本名著，名人传记、文学名著，或成功励志书籍都行。我还布置阅读名著的作业，让学生每天利用课间或课外时间读名著，每天阅读时间不少于20分钟；并且每单周抽出一节语文课作为“名著阅读课”，专门让学生自读名著，每双周抽出一节语文课进行“名著秀”，展示或表演读名著的收获，对表现好的予以奖励。

1.2.5浊度测定

CT扫描显示33例肿瘤边缘存在清晰界限或局限的病变范围，其中28例病灶周围硬化明显，软组织未发生肿块，5例骨皮质变薄但不存在骨膜反应。16例肿瘤边缘模糊，无明显界限，且周围软组织发现肿块，存在骨膜反应，2例骨皮质遭到破坏甚至中断，并且骨膜反应较为明显。

将1 mg冷冻干燥后的样品与150 mg KBr粉末混合研磨，然后将混合粉末压制成固体薄片[18]，使用FTIR-8400S型红外光谱仪进行全波段(4 000～400 cm-1)扫描，设置分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次。采用PeakFit 4.12软件进行拟合分析，通过酰胺Ⅰ区的反卷积算法计算不同蛋白样品中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲成分的含量。

1.2.9SPI-维生素D3纳米粒子的光稳定性

称取4 mg维生素D3溶于10 mL去离子水中，取10 mL不同均质次数的样品，分别置于直径90 mm的培养皿中，按以上方法每个样品制备9个，将其水平放置，用15 W的紫外灯近距离(20 cm)照射，每隔30 min取样一次，每个样品取出一个培养皿，每个培养皿取出0.5 mL样品，测定其中维生素D3含量。

1.3 数据分析

所有试验重复3次取平均值，采用SPSS 19.0进行数据处理和方差分析(ANOVA)，使用Origin 8.6软件制图，PeakFit 4.12软件计算蛋白二级结构。所有结果均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 纳米粒子粒径、多分散性指数和ζ-电位

如图1所示，经过高压均质处理后，SPI的平均粒径显著下降(P<0.05)，均在100 nm以下，平均粒径由384.33 nm减小至84.77 nm(表1)，同时随着均质次数的增加粒径分布逐渐由双峰分布转变为单峰分布，粒径分布更加均匀。样品在经历高压均质的过程中，在一定的压力下，流体被迫通过一些微米孔，流体在通过非常短的距离期间加速到非常高的速度，在经受空化、剪切和湍流等作用下，蛋白结构被破坏，其产生随机破裂，解离或解聚，导致粒径减小[19-21]。在高压均质处理次数为1～4次的过程中，随着均质次数的增加，样品的平均粒径逐渐减小，在均质次数为2次时，平均粒径最小，为84.77 nm，当均质次数继续增加时，平均粒径和多分散性指数(PDI)均略有增大，但不显著(P>0.05)。该结果可能由于样品被高压均质次数过多，反复经受物理作用，导致蛋白质重新聚合，粒径增大[22]。

图1 均质次数对SPI及SPI-维生素D3纳米粒子粒径分布的影响Fig.1 Effect of high pressures homogenization times on particle size distribution of SPI and SPI-VD3 nano-particles

SPI-维生素D3纳米粒子在经历0～4次高压均质处理后，粒径变化趋势与SPI经受高压均质后粒径变化相同，平均粒径由145.20 nm减小至82.00 nm。在经受相同次数的高压均质条件下，SPI-维生素D3纳米粒子与SPI相比有更小的粒径，这也说明维生素D3与SPI相互作用后使复合物结合更加紧密。

由表1可知，SPI与SPI-维生素D3纳米粒子均带负电荷，有效的表面电荷主要决定悬浮颗粒的分散和聚集，更多的表面负电荷使颗粒之间的静电排斥增强，可以使胶体聚集体破坏并防止进一步聚集[23-24]。样品经受高压均质处理后，电位的绝对值略有减小，当高压均质3次和4次后，电位的绝对值显著减小，该结果可归因于蛋白变性和聚集的形成。

表1 均质次数对SPI-维生素D3纳米粒子粒径、PDI、ζ-电位的影响Tab.1 Effect of high pressure homogenization times on particle size, PDI, ζ-potential of SPI-VD3 nano-particles

2.2 纳米粒子负载率和包封率

在SPI-维生素D3纳米粒子制备过程中，许多参数都会影响SPI-维生素D3纳米粒子的性质和负载率和包封率，表2中体现了均质次数对负载率和包封率的影响。未经高压均质处理的SPI-维生素D3样品的负载率为62.00%，包封率为6.20%，即维生素D3负载量可达到62.0 μg/mg，均质压力为100 MPa、均质次数为2次时，负载率和包封率显著提高，负载率达到79.21%，包封率达到7.92%，与未均质样品相比提高了27.7%，这归因于微通道中剪切、撞击和空化等作用使SPI表面疏水性变化从而使更多的维生素D3可以和SPI疏水基团发生作用[25]。文献[26]指出氢键和弱分子间作用力可以在均质作用下断裂从而导致蛋白质分子结构的变化，暴露出更多疏水基团，与本试验结果一致。当均质次数达到3次后包封率和负载率均有所下降。本团队在之前的研究中发现SPI与维生素D3结合为非共价结合，主要作用力为疏水相互作用和静电相互作用[27]，均质次数较多时，强的剪切、湍流等作用对已经结合的SPI-维生素D3的非共价键产生了破坏。在高压均质过程中，一方面改变SPI的结构，提高其与维生素D3的相互作用，另一方面，过强的高压均质破坏SPI与维生素D3之间的非共价键而不利二者结合。文献[28]在研究高压均质压力对SPI-维生素D3纳米复合物影响时得到了同样的结论。

表2 均质次数对SPI-维生素D3纳米粒子负载率和包封率的影响Tab.2 Effect of high pressure homogenization times on EE and LE of SPI-VD3 nano-particles %

2.3 纳米粒子浊度

由图2(图中相同参数不同字母表示差异显著，下同)可见，由于未均质的SPI样品和SPI-维生素D3体系中存在大量沉积在底部的高分子聚合物，导致体系浊度较大；经过高压均质的强剪切力和空化的作用力后，大的蛋白聚集体分散成小的亚基，使溶液中小聚集体数量增多，进而使浊度减小，该结果也可能与蛋白的溶解度有关，高压均质改变蛋白结构，增大其在水中的溶解性，从而使浊度减小。文献[14]研究发现未被处理的SPI溶液呈现低溶解度、高浊度，经过超声空化作用处理后蛋白溶解性显著提高，浊度降低。当均质3、4次时，浊度不再减小，反而略有提高，这可能是因为解离的小分子重新聚集。

图2 均质次数对SPI-维生素D3纳米粒子浊度的影响Fig.2 Effect of high pressure homogenization times on turbidity of SPI-VD3 nano-particles

2.4 纳米粒子表面疏水性

图3显示了SPI与SPI-维生素D3纳米粒子经过不同次数高压均质处理后的表面疏水性的变化。均质0～3次时，SPI的表面疏水性指数显著提高(P<0.05)，由1 134.8增大到1 537.2。该现象主要是由于高压均质可以对蛋白的大聚集体进行破坏，使蛋白结构更加伸展，深埋在内部的疏水基团暴露于外部[29]。SPI-维生素D3的表面疏水性指数也随高压均质次数增大呈现出增大的趋势，但其表面疏水性指数均低于单纯的SPI，该结果可能因为维生素D3与蛋白疏水基团相互作用使表面疏水性降低，文献[30]研究维生素D3与β-乳球蛋白相互作用时指出维生素D3可能通过蛋白表面的疏水基团与其结合。适当的均质次数可以有效地增大样品的表面疏水性，而次数过多可能会使已经打开的蛋白结构重新聚合，由图3可知，当均质次数为3次和4次时，高压均质已经不再显著改善表面疏水性，反而可能对蛋白产生了不利的影响。蛋白质-生物活性成分纳米复合物是基于蛋白质与(难溶)生物活性物质之间的疏水相互作用而构建的纳米输送载体，疏水作用是一种熵驱动的自发过程，活性物质与蛋白的疏水位点接触的可能性是两者相互作用发生的关键，本试验采用高压均质法改变蛋白表面疏水性进而提高负载量。

图3 均质次数对SPI-维生素D3纳米粒子表面疏水性指数的影响Fig.3 Effect of high pressure homogenization times on surface hydrophobicity of SPI-VD3 nano-particles

2.5 纳米粒子内源荧光光谱

固定激发波长290 nm，扫描不同均质次数处理后样品的内源荧光光谱。从图4可以看出，与未经高压均质处理的样品相比，样品经高压处理后，荧光强度明显增强，更多的色氨酸残基被暴露。荧光强度与均质次数不完全呈正相关关系，高压均质使荧光强度增强，而维生素D3的存在可能使蛋白结构改变，发色基团色氨酸的微环境发生变化，进而改变其对荧光的敏感程度，使荧光强度降低。当内部色氨酸被其他构象遮蔽时也会使蛋白荧光发生猝灭[31]。

图4 均质次数对SPI-维生素D3纳米粒子内源荧光光谱的影响Fig.4 Effect of high pressure homogenization times on surface fluorescence spectroscopy of SPI-VD3 nano-particles

2.6 纳米粒子傅里叶红外光谱

图5 均质次数对SPI-维生素D3纳米粒子傅里叶红外光谱的影响Fig.5 Effect of high pressure homogenization times on surface Fourier infrared spectroscopy of SPI-VD3 nano-particles

表3 不同均质次数下SPI-维生素D3纳米粒子中蛋白二级结构相对含量Tab.3 Effect of high pressure homogenization times on protein secondary structure in SPI-VD3 nano-particles %

2.7 纳米粒子光稳定性

文献[36]提出维生素D3的光稳定性较差，维生素D3及不同高压均质压力下制备的各SPI-维生素D3纳米粒子被放置于15 W的紫外灯下照射，各样品中维生素D3的降解情况如图6所示。维生素D3在水中降解较快，在紫外灯下照射4 h后，仅剩余18%，而与SPI发生相互作用后，维生素D3的光稳定性明显提高，这可能因为大豆蛋白中的芳香族羟基和双键可吸收紫外线，从而降低紫外线强度，达到保护维生素D3的作用[37]。均质压力为0 MPa时样

品在4 h紫外照射后维生素D3剩余24%，随着均质次数的增多，样品的光稳定性进一步提高，当均质次数为2次时，维生素D3质量分数提高到48%，与未均质样品相比提高了166.6%，SPI-维生素D3纳米粒子的光稳定性得到改善。该结果表明适当的高压均质能促进SPI与维生素D3的结合，达到更好保护维生素D3的作用。

图6 均质次数对SPI-维生素D3纳米粒子光稳定性的影响Fig.6 Effect of high pressure homogenization times on light stability of SPI-VD3 nano-particles

3 结束语

适当的高压处理能够提高SPI-维生素D3纳米粒子的性质。当高压均质压力为100 MPa、高压均质次数为2次时，制备的SPI-维生素D3纳米粒子的平均粒径由145.20 nm减小至82.00 nm，浊度减小，体系更均一；包封率和负载率较高，分别为79.21%和7.92%，负载率提高了27.7%；SPI及SPI-维生素D3纳米粒子的表面疏水性均增大，有利于SPI与维生素D3的结合；内源荧光光谱和傅里叶红外光谱表明，高压均质使复合物的结构发生变化，α-螺旋和β-折叠逐渐转变成β-转角；高压均质处理使SPI-维生素D3纳米粒子的光稳定性显著提高，与纯维生素D3相比，紫外灯下照射4 h后维生素D3的质量分数由18%提高至48%，提高了166.6%。本文认为，SPI-维生素D3纳米粒子负载率的提高及光稳定性的改善与SPI结构展开、疏水基团暴露有一定关联。