SPI凝胶颗粒制备及其Pickering高内相乳液特性研究

江连洲 温家煜 王禹涵 罗小雪 姜思岐 隋晓楠

(东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030)

0 引言

Pickering高内相乳液是一种利用水和油部分润湿的固体颗粒充当稳定剂、内相体积分数在74%以上的乳液。与传统的通过大量小分子表面活性剂稳定的高内相乳液相比，通过固体颗粒稳定的Pickering高内相乳液具有乳化剂用量少、稳定性好、生物相容性好、可塑性强等优势[1]。高内相乳液具有内相比例大、稳定性极佳、模版材料空隙均匀等特性，目前已被应用于食品药品加工[2]、生物组织工程[3]、化妆品[4]等多种领域中。Pickering高内相乳液的颗粒稳定剂包括改性二氧化硅[5]、二氧化钛凝胶颗粒[6]、羟磷灰石[7]、吐温80[8]和微凝胶颗粒[9]等，这些无机材料和化学合成的颗粒在生物安全性、生物相容性和生物降解性等方面具有毒性风险，极大地限制了Pickering高内相乳液在食品医药领域的应用。

大豆分离蛋白(Soy protein isolate, SPI)中蛋白质质量分数在90%以上，氨基酸种类有近20种，并含有人体所必需的氨基酸，具有凝胶性、吸水性、乳化性、起泡性等多种功能性质[10]。在受热时，由于球蛋白自身结构的改变，使埋藏在蛋白分子内的疏水基团暴露出来，可以形成自组装的凝胶颗粒聚集体。由于SPI凝胶颗粒具有亲水亲油性，已被广泛用作各种乳液的稳定剂[11]。

近年来，随着人们对低反式脂肪酸食品的关注，有关采用天然材料稳定的Pickering高内相乳液方面的研究迅速增多。文献[2]研究发现，小麦淀粉稳定的高内相乳液在成为蛋黄酱替代物方面有巨大潜力。文献[12]使用乳清蛋白微凝胶制备的高内相乳液在4℃下储存6个月仍能显示出优异的稳定性，但该研究使用的颗粒需要进行化学改性，以提升界面稳定性。文献[13]用己烷作内相，成功制备了由麦醇溶蛋白-壳聚糖复合颗粒作为稳定剂、内相体积分数可高达90%的高内相乳液。此外，许多研究发现，一些食品级颗粒可以成功制备Pickering高内相乳液，如乳清蛋白微凝胶[14]、纤维素凝胶颗粒[15]、淀粉凝胶晶体[16]和花生蛋白微凝胶颗粒[17]等，但这些稳定剂大多需要酸化、糖基化等复杂且费时的修饰，或在制备过程中仍需使用一些有机溶剂(如丙酮等)。因此，繁琐的制备过程和化学材料的残留等问题仍限制了Pickering高内相乳液在食品行业中的应用。

本文主要研究SPI凝胶颗粒在制备Pickering高内相乳液中的作用，以期为食品工业提供一种制备方法更便捷、材料更安全的稳定剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆粉，哈尔滨高新技术有限公司；葵花籽油 (市售)；正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、邻苯二甲醛(OPA)、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、去离子水等，北京新光化工试剂厂；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CJJ-6型磁力搅拌器，上海仪电科学仪器股份有限公司；GL-25MS型高速冷冻离心机，宁波Scientz生物技术有限公司；PHS-25型数显台式酸度计，上海雷磁公司；HH-6型数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；Scientz-18N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；2500C型高速研磨机，永康市艾泽拉电器有限公司；T10-Ultra Turrax型均质器，德国IKA公司；NANO ZS90型粒度与电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；F-4500型荧光分光光度计，日本日立公司；BX53型科研正置光学显微镜，日本奥林巴斯有限公司；Quorum PP310T型低温冷冻系统、Hitachi-S-3400N型扫描电子显微镜，荷兰皇家飞利浦公司；MCR302型流变仪，奥地利安东帕公司。

1.3 方法

1.3.1SPI的制备

参照文献[18]的制备方法。将大豆粉首先在45℃溶于正己烷(液料比3 mL/g)脱脂2 h。将脱脂的大豆粉晾干后溶于去离子水中(液料比15 mL/g)萃取2 h，用1 mol/L NaOH将pH值调节至8.5并搅拌2 h。然后将混合物在9 000g、4℃下离心20 min以除去不溶物，并用1 mol/L HCl将上清液pH 值调节至4.5后静置30 min，然后将上清液在6 000g、4℃下离心20 min。收集沉淀物，随后用0.1 mol/L HCl将pH值调节至7.0。将沉淀物冷冻干燥后，获得干基蛋白质质量分数为90.2%的大豆分离蛋白。

1.3.2SPI凝胶颗粒的制备

将冷冻干燥的SPI粉末溶解于去离子水(液料比20 mL/g)中，并搅拌2 h。然后将悬浮液在4℃下储存12 h，以使蛋白质完全水化。使用0.01 mol/L HCl或NaOH将悬浮液的pH值调节至7.0，并在80℃的水浴中缓慢搅拌30 min。然后将悬浮液自然冷却至室温(20℃)即形成由SPI自组装的凝胶颗粒凝胶。用T10-Ultra Turrax型均质器以10 000 r/min的速度破碎凝胶3 min，使凝胶颗粒分散得更加均匀。

1.3.3SPI凝胶颗粒的粒径和ζ-电位

利用NANO ZS90型粒度与电位分析仪对所有样品进行粒径分布和ζ-电位测定，参照文献[19]的方法稍加修改。为了研究pH值(3.0～10.0)对SPI凝胶颗粒的粒径和ζ-电位的影响，并避免多个凝胶颗粒的相聚集影响测量，将样品用不同pH值的 0.01 mol/L 缓冲溶液稀释100倍后测量粒径，稀释1 000倍后测量电位。

1.3.4SPI凝胶颗粒表面疏水性分析

表面疏水性指数H0根据文献[20]的方法稍加修改，使用ANS荧光探针测定蛋白质的表面疏水性。将不同pH值的SPI凝胶颗粒用 0.01 mol/L 磷酸缓冲溶液稀释样品，使最终质量浓度为0.04～0.2 mg/mL；同时使用pH值7.0的磷酸缓冲溶液配制ANS储备液(8.0 mmol/L)。取4 mL各稀释样品加入15 μL ANS溶液，振荡混合均匀后静置10 min，使用荧光光度计在激发波长为370 nm、发射波长为470 nm下测量混合物的荧光强度。以荧光强度对蛋白质质量浓度(mg/mL)的初始斜率(通过线性回归分析计算)制图用作表面疏水性指数计算。

1.3.5SPI凝胶颗粒微观结构观察

参照文献[21]的方法并稍作修改。使用Hitachi-S-3400N型扫描电子显微镜对SPI凝胶颗粒进行微观观察。将一滴SPI凝胶颗粒样品置于载物台上，并用液氮冷冻。随后在真空条件下，将样品转移至-160℃的制备室(Quorum PP310T型低温冷冻电镜制备系统)中，并用刀片横切样品。然后将样品在-100℃下升华15 min。最后，将样品表面喷涂上金，并转移至扫描电子显微镜的冷冻室内拍摄图像，冷冻室温度控制在-140℃。

1.3.6Pickering高内相乳液的制备

将新鲜制备的SPI凝胶颗粒分散在去离子水中，使分散液中蛋白质质量分数为1.00%。通过滴加0.01 mol/L HCl或NaOH将分散液的pH值分别调节至4.5、7.0和9.0。然后使用T10-Ultra Turrax型均质器以10 000 r/min对SPI凝胶颗粒分散液均质1 min。

为了研究乳液形成时的内相体积分数对乳液结构的影响，在上述SPI凝胶颗粒分散液中滴加体积分数为10%、30%、50%、70%、78%、80%、82%的葵花籽油，用T10-Ultra Turrax型均质器于6 000 r/min均质2 min，形成乳液，当内相体积分数大于74%时，形成Pickering高内相乳液。

1.3.7Pickering高内相乳液微观观察

使用光学显微镜观察乳液的微观结构。将一滴乳液和Pickering高内相乳液放入显微镜载玻片上，小心地使用盖玻片固定并确保内部没有气泡。图像以40倍放大率拍摄。

参照文献[19]的方法并稍作修改。使用冷冻扫描电子显微镜对Pickering高内相乳液进行观察。将一滴乳液样品置于载物台上，并用液氮冷冻。随后在真空条件下，将样品转移至-95℃的制备室中，并用刀片横切样品。然后将样品在-100℃下升华15 min。最后，将样品表面喷涂上金，并转移至扫描电子显微镜的冷冻室内拍摄图像，冷冻室温度控制在-170℃。

1.3.8Pickering高内相乳液流变测量

参照文献[2]的方法，使用旋转黏度计测量乳液的流变行为，在25℃下椎板之间的间隙设置为0.80 mm。在扫频模式下，设定恒定应变为0.5%，在0.1～10 Hz频率下测量Pickering高内相乳液的弹性模量和黏性模量。

1.4 数据统计分析

所有测量至少进行3次，结果表示为平均值±标准差。利用SPSS Statistics 24软件对数据进行ANOVA和Duncan检验(p<0.05)统计分析。

2 结果与分析

2.1 SPI凝胶颗粒粒径分析

如图1所示，在pH值为4.0和5.0时，0.01%的SPI凝胶颗粒分散液为不稳定的悬浮液，形成了肉眼可见的聚集体，所以不能通过NANO ZS90型粒度与电位分析仪准确测量该pH值条件下SPI凝胶颗粒的平均粒径，测得其聚集体的粒径为3 443.0～4 502.0 nm。SPI凝胶颗粒平均粒径随pH值的变化差异显著(p<0.05)。当pH值为3.0时，平均粒径为258.6 nm。当pH值在6.0～10.0时，SPI凝胶颗粒粒径依次为170.7、248.8、268.5、302.7、305.2 nm，呈逐渐升高趋势，但整体变化并不明显。该粒径范围与其他作为高内相乳液稳定剂的蛋白颗粒大小研究结果相似，如文献[22]发现明胶颗粒的平均粒径为235.9 nm，文献[17]发现花生蛋白颗粒的粒径为40～150 nm。在碱性条件下，SPI凝胶颗粒粒径较大。因为该颗粒是一种微凝胶颗粒，具有一定程度的吸水和溶胀能力[23]，所以粒径的轻微增加应为SPI颗粒的吸水性引起的，而非颗粒间聚集。本试验中的SPI凝胶颗粒平均粒径大于文献[24]报道的大豆蛋白凝胶的流体动力学直径(141.0～158.0 nm)。该差异是由于本试验制备SPI凝胶颗粒时蛋白质质量分数(5%)较高，是文献[24]的2倍。蛋白质浓度对热诱导蛋白质聚集产生自组装凝胶颗粒有着重要影响[25]。在较低的蛋白质浓度下，球状蛋白质之间的热诱导相互作用往往发生在分子内而不是分子间。随着蛋白质浓度的增加，SPI形成分子间相互作用，并最终形成蛋白质凝胶。所以蛋白浓度对其形成的热凝胶颗粒粒径存在一定影响。

图1 不同pH值条件下的0.01%大豆分离蛋白凝胶颗粒悬浮液Fig.1 0.01% soybean protein isolate gel particle suspension at different pH values

2.2 SPI凝胶颗粒ζ-电位分析

SPI凝胶颗粒ζ-电位随pH值变化。在pH值低于5.0时观察到SPI凝胶颗粒呈现正电性(pH值为3.0时ζ-电位为22.32 mV，pH值为4.0时ζ-电位为9.33 mV)，这是因为SPI颗粒表面引入带正电的氨基。当pH值超过5.0时，由于羧基的去质子作用，SPI凝胶颗粒趋于带负电，在pH值为5.0～10.0时，ζ-电位依次为-3.17、-20.00、-28.25、-24.20、-26.94、-30.83 mV，在pH值为7.0～10.0时变化并不明显。本研究中观察到SPI凝胶颗粒的ζ-电位随pH值变化的趋势与文献[26]的结果相似。SPI凝胶颗粒对pH值变化非常敏感，当ζ-电位绝对值较小时, 凝胶颗粒表面所带的同性电荷较少,减小了静电排斥作用。进而降低了分散液稳定性,使体系中蛋白分子倾向于相互聚集，这与图1和粒径变化中观察到的结果一致。当SPI凝胶颗粒的ζ-电位趋近于零时，pH值约为4.5，与 SPI的等电点(pH值为4.5)相近，因此SPI凝胶颗粒的制备工艺对SPI的等电点几乎没有影响。当pH值大于5.0时，SPI凝胶颗粒ζ-电位的绝对值逐渐增大，并在碱性条件下逐渐趋于稳定。因为在碱性条件下SPI凝胶颗粒表面同性电荷增多，同性电荷间的相互排斥使蛋白质溶液更稳定，减弱了蛋白颗粒分子间的相互作用，促进SPI凝胶颗粒作为Pickering高内相乳液的稳定剂。

2.3 SPI凝胶颗粒表面疏水性分析

蛋白质的表面疏水性指数H0是影响蛋白颗粒表面相关功能的重要参数。在pH值为3.0～6.0时，SPI颗粒表面疏水性指数很高,依次为15 762.00、16 768.40、10 183.00、4 409.80，H0在等电点附近(pH值为4.0～5.0时)出现最大值。由图1和表面疏水性指数H0对比可知，SPI蛋白凝胶颗粒的表面疏水性与溶解度呈负相关。蛋白质的溶解度取决于蛋白质分子的亲/疏水平衡, 这种平衡主要取决于暴露于蛋白质分子表面的氨基酸组成。在氨基酸侧链残基中,疏水性残基通过疏水键于蛋白质分子中心相互结合, 形成疏水区域；而亲水性残基排列于能够与水分子接触的蛋白质分子外侧, 形成亲水区域[27]。当pH值从7.0增加到10.0时，SPI凝胶颗粒的疏水性维持在较低水平，H0依次为1 541.26、697.56、831.00、673.90，且pH值在8.0～10.0间SPI颗粒的表面疏水性指数相差较小，表明蛋白质倾向于折叠，这导致疏水残基被掩埋，阻止了蛋白质颗粒疏水区的暴露，从而抑制了SPI凝胶颗粒的疏水性。文献[28]研究发现，肉类蛋白热凝胶颗粒在不同pH值下的疏水性趋势与本文结果一致。文献[29]的研究表明在中性pH值下SPI的表面疏水性指数为55.32。与其相比，本研究的SPI凝胶颗粒的H0明显高于其他研究。其原因可能为热处理诱导SPI折叠，导致更多疏水性基团迁移到分子外部。因此，疏水相互作用和电荷间排斥作用可能是蛋白质粒子排列形态不同的原因[30]。

2.4 SPI凝胶颗粒微观结构分析

可通过冷冻扫描电子显微镜观察SPI凝胶颗粒在不同pH值下的微观结构。本研究选取3个具有代表性的pH值，即等电点(pH值为4.5)、中性点(pH值为7.0)和中等碱性点(pH值为9.0)进行pH值对SPI凝胶颗粒微观结构影响的分析。如图2所示，可以观察到单个的SPI凝胶颗粒均具有球形外观，直径为70～250 nm。在不同的pH值条件下，SPI凝胶颗粒处于不同的聚集状态。当pH值为4.5时，由于此时处于等电点， SPI凝胶颗粒间静电斥力降低，具有较强的范德华力[21]，因此颗粒形成了较大的圆形聚集体。当pH值为7.0时，颗粒以条带型相联，形成一些椭圆形的聚集体。当pH值为9.0时，几乎所有颗粒都被交联且紧密融合在一起，形成较为均一的微凝胶网络状结构。SPI凝胶颗粒融合的凝胶网络状结构可以共同作用于水/油界面，对Pickering高内相乳液进行稳定。

图2 大豆分离蛋白凝胶颗粒冷冻扫描电镜图像Fig.2 Cryo-scanning electron microscopy analysis of soybean protein isolate gel particles

2.5 Pickering高内相乳液外观观察

由图3可以看出，不同pH值条件下得到的SPI凝胶颗粒制备的Pickering高内相乳液具有不同的状态。当pH值为4.5和7.0时，乳液形成了聚集体或絮凝物，出现了明显的相分离情况，表明在此pH值条件下无法制备出稳定、均一的高内相乳液。当pH值为9.0时，Pickering高内相乳液外观均匀统一，结构细腻，呈乳白色，表明在碱性条件下制备的SPI凝胶颗粒更有利于稳定Pickering高内相乳液。

如图4所示，为了进一步研究内相体积分数对形成乳液外观稳定性与微观结构的影响，在pH值为9.0 的条件下制备了蛋白质质量分数为1.00%、内相体积分数不同的Pickering乳液。当内相体积分数为10%～70%时，此时乳液不能被称为高内相乳液。该乳液体系出现明显的分层现象，并且随着油相浓度的增加，上层乳白色絮状层增厚。当内相体积分数不断增加至82%时，形成了稳定的高内相乳液。其表面呈奶油状，细腻均一，较为黏稠，流动性差，在常温下放置14 d仍未出现相分离现象。

图3 不同pH值的大豆分离蛋白凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液Fig.3 High internal phase Pickering emulsions stabilized bysoybean protein isolate gel particles of different pH values

图4 大豆分离蛋白凝胶颗粒稳定的不同内相体积分数的Pickering乳液Fig.4 Pickering emulsions with different internal phase volume fractions stabilized by soybean protein isolate gel particles

2.6 Pickering高内相乳液光学显微镜观察

SPI凝胶颗粒稳定的Pickering 高内相乳液的40倍光学显微镜下微观结构如图5所示，由图5可知，所有由pH值9.0的SPI凝胶颗粒稳定的高内相乳液微观结构均呈现圆形液滴状，液滴粒径在5～50 μm之间，变化较大。当内相体积分数小于70%时，液滴随机分散分布，随着内相体积分数的增加，形成高内相乳液后，液滴处于更紧密的填充状态，排列整齐，相互连接，形成一个致密的网络状油滴体系。随着内相体积分数的增加，乳液的液滴尺寸逐渐减小，表明较高的内相体积分数有利于形成更稳定的凝胶状结构，这与文献[31]的试验结果一致。

图5 不同内相体积分数的Pickering乳液的光学显微镜图像Fig.5 Observation of Pickering emulsion optical microscope with different internal phase volume fractions

图6 Pickering高内相乳液的冷冻电镜图像Fig.6 Observation of Pickering high internal phase emulsion cryo-scanning electron microscope

2.7 Pickering高内相乳液冷冻电镜观察

如图6所示，用冷冻电镜对SPI凝胶颗粒稳定的Pickering高内相乳液进行了表征，有利于更清晰直观地了解高内相乳液的微观结构。所有的油滴都被包裹在由SPI凝胶颗粒构成的三维网状结构中。SPI凝胶颗粒在油滴表面形成的紧密填充层为Pickering高内相乳液整体充当空间屏障，增强液滴间稳定性[32]。此外，SPI凝胶颗粒可以桥接相邻液滴，从而形成自组装结构，这也是Pickering乳液的特点之一[19]。随着内相体积分数从78%增加到82%，油滴尺寸减小，且油滴间分布更加紧密。这一结果与光学显微镜观察结果一致。

图7 Pickering高内相乳液流变分析图Fig.7 Rheological analysis diagram of Pickering high internal phase emulsions

2.8 Pickering高内相乳液流变分析

图7a显示了在内相体积分数为78%～82%、蛋白质质量分数为1.00%时，Pickering高内相乳液的静态流变分析图。随着剪切速率的增大乳液黏度逐渐下降，表现出典型非牛顿假塑性行为。这是乳液间的弱缔合相互作用所导致的，文献[33]所报道的钙离子诱导交联的乳清蛋白纳米颗粒稳定的高内相乳液也具有这种显著的剪切稀化行为。此外，在相同的剪切速率下，Pickering高内相乳液的内相体积分数越高，表观黏度越大。文献[34]得到相似的结论，即随着辛烯基琥珀酸酐淀粉浓度和分散相体积分数的增加，乳液的表观黏度和假塑性特性都有所增加。图7b显示了在内相体积分数为78%～82%、蛋白质质量分数为1.00%时，Pickering高内相乳液的弹性模量和黏性模量的变化。随着频率的增加，Pickering 高内相乳液的弹性模量和黏性模量逐渐增大，并且弹性模量始终大于黏性模量，证实了SPI凝胶颗粒稳定的Pickering 高内相乳液具有弹性凝胶特征，并且弹性模量的变化与频率变化无关。乳清蛋白、小麦醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白稳定的高内相乳液[35-36]都具有相似的弹性凝胶乳液特征。在同一频率下，随着内相体积分数的增大，弹性模量与黏性模量都逐渐增大。说明Pickering高内相乳液的流变性能受内相体积分数的影响，较高内相体积分数的油滴间具有更紧密的网络状结构，对形成刚性乳液有一定的作用。

3 结论

(1)以pH值为9.0的大豆分离蛋白凝胶颗粒作为Pickering高内相乳液稳定剂，制备了无表面活性剂的食品级Pickering高内相乳液，其内相体积分数可达到82%。

(2)pH值对大豆分离蛋白凝胶颗粒具有显著的影响。在碱性条件下，SPI凝胶颗粒平均粒径较大，约为300 nm，ζ-电位绝对值最大，颗粒相互交联且紧密融合，形成均匀的凝胶网络状结构。以此大豆分离蛋白凝胶颗粒制备出了稳定性较强的Pickering高内相乳液。

(3)对大豆分离蛋白凝胶颗粒稳定的不同内相体积分数的Pickering高内相乳液进行了宏观与微观观察，发现随着内相体积分数的增大，高内相乳液更为粘稠，形成更加细小致密的多孔结构，保证了乳液的机械稳定性。