骶神经根磁刺激对神经源性膀胱大鼠膀胱尿流动力学及M3受体表达的影响

王彦彬 李瑞鹏 楼扬锋 杨龙飞 季泽益 宋晨

中枢神经系统或周围神经系统损伤导致的膀胱功能障碍称为神经源性膀胱[1]，临床表现为膀胱高压、尿失禁、反复尿流感染、肾积水、尿毒症等，治疗相当棘手，是迄今尚未解决的医学难题。近年来，随着神经泌尿领域的快速发展，骶神经根磁刺激技术作为一种非侵入性、无创的神经刺激系统的新技术，显示出良好的应用前景。本实验通过制备大鼠神经源性膀胱模型，观察骶神经根磁刺激对脊髓损伤后膀胱尿流动力学及膀胱逼尿肌组织中M3受体表达的影响，探讨潜在的机制，以期为解决临床难题提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雌性成年SD大鼠60只，购自上海斯莱克[合格证号：SCXK（沪）：2017-004]。

1.2 动物分组与处理 按随机数字表法将60只大鼠分为3组：正常组、模型组、磁刺激组，每组20只。除正常组（不作任何处理）外，其余两组采用脊髓横断切除法建立神经源性膀胱动物模型[2]：大鼠腹部皮下注射2%戊巴比妥钠作麻醉处理，四肢外展固定于实验木板上，剃毛，常规消毒。依次切开大鼠背部皮肤及皮下组织，沿棘突纵行劈开大鼠双侧竖棘肌，在T9节段切除脊髓组织，清除损伤腔内残留的淤血及神经组织，后逐层缝合伤口，消毒，模型构建完毕。每只大鼠单笼饲养，初期采用腹部按压方式辅助排尿。磁刺激组大鼠造模成功1 d后给予第1次骶神经根磁刺激治疗：使用武汉依瑞德公司生产的磁刺激仪，将圆型线圈放置在大鼠骶骨处，磁刺激仪连接电源，频率设置为0.5 Hz，以大鼠骶部和（或）尾部颤动而不致全身颤动的表现为宜，给予1次/d，每次30个刺激冲动，每个刺激冲动间隔2 min，连续治疗8周。模型组将圆型线圈放置在大鼠骶骨处，但不连接电源，不进行磁刺激。3组大鼠均常规饲养。在建模及治疗期间，模型组死亡4只，磁刺激组死亡5只，最终正常组、模型组、磁刺激组分别有20、16、15只大鼠完成实验。治疗结束后，麻醉大鼠行膀胱尿流动力学测定，处死大鼠取膀胱逼尿肌组织行HE染色和超微结构观察，同时检测膀胱逼尿肌组织中M3受体表达水平。

1.3 膀胱尿流动力学测定 乙醚麻醉大鼠，插入F2测压导管至膀胱，与尿动力学测压管连接，调零后用微量灌注泵以2 ml/h速率灌注0.9%氯化钠溶液[3]。记录膀胱最大容量、膀胱漏尿点压力、膀胱顺应性等尿流动力学参数。其中膀胱最大容量为当出现尿道口连续漏尿时膀胱的总灌注量；膀胱顺应性=灌注量/漏尿点压力。

1.4 膀胱逼尿肌组织学观察 采用HE染色法。切取大鼠膀胱全层组织，10%甲醛固定、石蜡包埋、切片，置于68℃烤箱烤片1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇（浓度从高到低）脱水，流水冲洗数分钟，苏木素染色0.5 h，流水返蓝数分钟，伊红染色5 s，梯度乙醇（浓度从低到高）脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，在光镜下观察。

1.5 膀胱逼尿肌超微结构观察 取大鼠膀胱逼尿肌组织（约1 mm×1 mm×1 mm），置于4%戊二醛溶液低温固定、石蜡包埋、预切片（厚4～6 mm），锇酸染色定位后进行超薄切片（厚0.1 μm），在透射电镜下观察。

1.6 膀胱逼尿肌组织中M3受体表达水平检测 采用免疫组化SP法（免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司）。取大鼠膀胱逼尿肌组织，石蜡包埋、切片、脱蜡、梯度乙醇水化，3% H2O2、37℃孵育，PBS冲洗，枸橼酸钠高温高压抗原修复3 min后自然冷却；山羊血清封闭10 min后，倾去血清，滴加一抗（兔抗M3R受体）室温孵育1 h，阴性对照用PBS代替一抗，PBS洗涤5 min×3次，滴加兔型二抗，室温孵育0.5 h，PBS冲洗5 min×3次，行DAB显色，在光镜下观察，细胞质呈棕黄色为阳性表达。使用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，利用Image pro-plus 6.0软件计算平均吸光度（A值），即大鼠膀胱逼尿肌组织中M3受体表达水平。

1.7 统计学处理 采用SAS 8.0统计软件。计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠膀胱尿流动力学参数比较 3组大鼠膀胱最大容量、漏尿点压力、膀胱顺应性等尿流动力学参数比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中磁刺激组膀胱最大容量、膀胱顺应性均高于模型组（均P＜0.05），漏尿点压力低于模型组（P＜0.05）；而磁刺激组与正常组上述3个参数比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 1。

表1 3组大鼠膀胱尿流动力学参数比较

2.2 3组大鼠膀胱逼尿肌HE染色结果观察 正常组大鼠膀胱逼尿肌纤维排列整齐，细胞未见明显增大，未见炎细胞浸润，见图 1a（插页）；模型组大鼠膀胱壁结构不清，未见黏膜上皮，壁内大部分区域高度充血、出血，水肿，且壁内有少量坏死的肌纤维平行排列，并有轻度炎细胞浸润，见图1b（插页）；磁刺激组大鼠膀胱黏膜上皮细胞形态及排列接近正常组，局部细胞排列紊乱，肌层水肿，有轻度单个核炎细胞浸润，浆膜面增厚，浆膜下组织中度充血、水肿，有轻度单核巨噬细胞浸润，并有少量成纤维细胞增生，见图1c（插页）。

2.3 3组大鼠膀胱逼尿肌超微结构比较 正常组大鼠膀胱逼尿肌细胞结构正常，细胞间隙较窄，细胞器结构完整，见图2a；模型组大鼠膀胱逼尿肌细胞大小不一致，细胞间隙变宽，分布错乱，部分细胞线粒体肿胀破裂且呈空泡状，细胞连接纤维化、排列紊乱，见图2b；磁刺激组大鼠膀胱逼尿肌细胞表面平滑，细胞间隙稍宽，排列尚均匀，胞质内线粒体结构较完整，无肿胀破裂现象，见图2c。

2.4 3组大鼠膀胱逼尿肌组织中M3受体表达水平比较 3组大鼠膀胱逼尿肌组织中M3受体表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中磁刺激组明显高于正常组、模型组（均P＜0.05）；模型组与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2和图3（插页）。

图1 3组大鼠膀胱逼尿肌组织学观察所见（a：正常组；b：模型组；c：磁刺激组；HE染色，×400）

图2 3组大鼠膀胱逼尿肌超微结构比较（a：正常组；b：模型组；c：磁刺激组；×10 000）

图3 3组大鼠膀胱逼尿肌组织中M3受体阳性表达检测所见（a：正常组；b：模型组；c：磁刺激组；免疫组化SP法，×400）

3 讨论

中枢神经系统或周围神经系统损伤导致的膀胱功能障碍称为神经源性膀胱[1]，这类疾病在脊髓损伤患者中较为多见[4]，常见的临床表现有尿频、排尿费力、尿失禁、反复尿路感染等，严重者可出现肾积水、肾功能衰竭。因此，尽早干预治疗十分重要。目前临床上采取的治疗方法主要有留置尿管、药物治疗、手术治疗、骶神经调控等[5]，但各自都有一些弊端。比如留置尿管或自我清洁导尿需要患者自行操作，若操作不当，极易引发下尿路感染；而药物治疗作用进展缓慢或效果欠佳；手术治疗后需要长期带管生活，对患者造成极大不便。骶神经调控是一种微创可逆的治疗方法[6]，能取得一定的治疗效果，但也存在有创治疗、设备昂贵、易引发感染、病情反复等问题，因此限制了其大规模开展。

骶神经根磁刺激是一种电疗法。证据表明，它具有与骶神经电刺激相同的影响，可产生类似的电场，但磁刺激的阻抗更小，衰减更少[7-8]。另有研究表明，骶神经根磁刺激既能促进与抑制排尿相关物质的释放，也能起到改善膀胱排尿功能的作用[9-10]。本实验结果也发现，磁刺激组大鼠膀胱最大容量、膀胱顺应性均高于模型组，膀胱漏尿点压力低于模型组。M3受体存在于膀胱逼尿肌细胞膜上，介导逼尿肌细胞收缩[11]。有学者在大鼠去神经损伤模型中，发现M3受体表达水平明显升高，可能与大鼠去神经损伤后乙酰胆碱递质减少，逼尿肌收缩力下降，M3受体代偿性上调以维持逼尿肌收缩功能有关[12-13]。在本实验中，磁刺激组HE染色可见浆膜下组织中度充血、水肿，有轻度单核巨噬细胞浸润，并有少量成纤维细胞增生，但黏膜上皮细胞形态及排列较模型组接近正常；在透射电镜下可见逼尿肌细胞表面平滑，细胞间隙稍宽，排列尚均匀，胞质内线粒体结构较完整；而免疫组化结果显示膀胱逼尿肌组织中M3受体表达水平较正常组和模型组明显升高。

表2 3组大鼠膀胱逼尿肌组织中M3受体表达水平比较

综上所述，骶神经根磁刺激对神经源性膀胱大鼠的膀胱功能有一定的改善作用，可能与膀胱逼尿肌组织中M3受体表达升高有关，其具体作用机制有待进一步探讨。