酶法合成氨苄西林时酶与悬浮液的分离研究

黄国明，王欣，严正人，张海燕，魏士倩

（1.华北制药集团先泰药业有限公司，石家庄 052165；2.河北省半合青类相关酶及应用技术创新中心，石家庄 052165）

氨苄西林（Ampicillin），是一种β-内酰胺类抗生素，具有良好的抗菌效力和较低的毒副作用，在临床治疗中有着广泛的应用[1]。该药列于世界卫生组织基本药物标准清单，为基础公卫体系必备药物之一。氨苄西林的传统合成方法是把母核和侧链经过化学合成得到。近年来，由于绿色生产的需求，在水相中用固定化青霉素G 酰化酶（Penicillin G acylase，PGA）催化合成氨苄西林已经成为工业化生产氨苄西林的发展趋势而被广泛采用。

酶法合成氨苄西林的机理为：在PGA 催化下，底物6-APA与侧链PGM·HCl 反应生成氨苄西林（Ampicillin，合成反应Ⅰ），但同时，还有底物水解（PGM·HCl，反应Ⅱ）和产物水解（Ampicillin，反应Ⅲ），所有这些副反应（反应Ⅱ和反应Ⅲ）均会产生D-苯甘氨酸（PG）[2]。

图1 氨苄西林的酶法合成Fig.1 Enzymatic synthesis of ampicillin

酶法合成抗生素工艺在工业生产时，PGA的分离再生是关键技术之一，如果分离困难会导致生产工时的不可控制，影响后续工序的进行，最终影响产品收率和质量[3-4]。目前对酶法合成抗生素的研究主要集中在合成工艺优化及母液的回收[5-12]，对PGA与悬浮液分离过程的研究较少[13-17]。本试验室发现在酶法合成氨苄西林时，在机械搅拌力的作用下将PGA与悬浮液过筛网，目的是使悬浮液通过筛网，而PGA截留在筛网上面重复利用。但是在实际操作时，存在PGA与悬浮液难以分离的突出问题。本文叙述了采用一种直观、快速检测PGA与悬浮液分离速率的方法，分别从PGA 应用的角度、反应副产物、工艺条件三个方面，即PGA用量、PGA粒度、D-苯甘氨酸（D-phenylglycine，PG）的量、反应温度、反应浓度、在酶反应阶段加入晶种[18～20]对影响PGA与悬浮液分离速率的诸因素进行了考察，从而确定氨苄西林悬浮液分离速率为最合适试验条件，对产业化生产具有指导意义。

1 试验材料和仪器

1.1 试验材料

6-氨基青霉烷酸（6-Aminopenicillinic acid，6-APA）由珠海联邦制药股份有限公司提供、D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐（D-phenylglycine methyl ester hydrochloride，PGM·HCl）由河北省化学工业研究院提供、PGA 由湖南福来格生物技术有限公司提供。

1.2 试验仪器

电动搅拌器（德国IKA 公司，RW20D）、台式pH计（瑞士梅特勒-托利多公司，FiveEasy Plus）、生物显微镜（上海绘统光学仪器有限公司，XSP-9C）、循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司，SHB-Ⅲ）、PGA 分离器（自制，120 目筛网）。

2 试验方法

酶法制备氨苄西林成品的工艺参考以下步骤[21]：（1）将6-APA、PGM·HCl与PGA混合于水中，得混合液；（2）用酸或碱调节控制混合液的pH值，在一定温度下进行反应，待反应完全后，分离PGA与氨苄西林悬浮液；（3）将含有氨苄西林粗品的反应液用酸溶清，再用碱结晶，养晶，洗涤，干燥，得氨苄西林产品。

PGA与悬浮液分离速率的检测方法如下：将PGA 分离器（120 目筛网）安装在做好刻度标识的烧杯上，将搅拌桨安装在PGA 分离器内，开启搅拌，搅拌速度为45 r/min。将反应终点的料液全部倒入PGA 分离器中计时，在搅拌作用下含有氨苄西林粗品的料液透过筛网滴落到下面的烧杯中，记录不同时间对应的烧杯中料液体积。

本试验室采用的PGA与悬浮液分离速率的检测方法直观、快速，此方法同样适用于其他酶法合成抗生素时PGA与悬浮液分离速率的检测。

2.1 考察PGA 对分离速率的影响

2.1.1 考察PGA用量对分离速率的影响

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 纯化水，控制反应温度20℃，加入不同重量的PGA 开始反应，控制反应过程中pH为5.0～7.5，当6-APA 残留浓度低于10 mmol/L 时为反应终点，停止反应。将PGA 催化合成到达反应终点的氨苄西林悬浮液倒入PGA 分离器，测定PGA与悬浮液的分离速率。初始PGA 量为20 g，以初始PGA 量的2～3倍进行催化合成氨苄西林，即分别加入20 g、40 g、60 g PGA。

2.1.2 考察PGA粒度对分离速率的影响

在四口瓶中加入18 g 6-APA 、18 g PGM·HCl、150 mL 纯化水，控制反应温度20℃，加入不同粒度PGA（大粒度PGA粒径为300～600 μm，小粒度PGA粒径为300～400 μm）开始反应，控制反应过程中pH为5.0～7.5，当6-APA 残留浓度低于10 mmol/L 时为反应终点，停止反应。将PGA 催化合成到达反应终点的氨苄西林悬浮液倒入PGA 分离器，测定PGA与悬浮液的分离速率。

2.2 考察反应副产物对分离速率的影响

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 纯化水，控制反应温度20℃，加入20 g PGA开始反应，控制反应过程中pH为5.0～7.5，当6-APA残留浓度低于10 mmol/L 时为反应终点，在反应终点加入不同重量的PG 搅拌10 min后，将氨苄西林悬浮液倒入PGA 分离器，测定PGA与悬浮液的分离速率。PG 用量分别为0 g、0.2 g、0.4 g、0.6 g。

2.3 考察不同工艺条件对分离速率的影响

2.3.1 考察反应温度对分离速率的影响

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 纯化水，分别控制反应温度为10℃、20℃、30℃，加入20 g PGA 开始反应，控制反应过程中pH为5.0～7.5，当6-APA 残 留浓 度 低于10 mmol/L时为反应终点，停止反应。将PGA 催化合成到达反应终点的氨苄西林悬浮液倒入PGA 分离器，测定PGA与悬浮液的分离速率。

2.3.2 考察反应浓度对分离速率的影响

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 纯化水，控制反应温度为20℃，加入20 g PGA 开始反应，控制反应过程中pH为5.0～7.5，当6-APA 残留浓度低于10 mmol/L 时为反应终点，停止反应。将粗品分离后配制不同浓度的PGA与悬浮液，测定PGA与悬浮液的分离速率。

2.3.3 考察加入晶种对分离速率的影响

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 纯化水，控制反应温度为20℃，加入20 g PGA 开始计时，在反应5 min 时加入5%氨苄西林晶种，控制反应过程中pH为5.0～7.5，当6-APA 残留浓度低于10 mmol/L 时为反应终点，停止反应。将PGA 催化合成到达反应终点的氨苄西林悬浮液倒入PGA 分离器，测定PGA与悬浮液的分离速率。

3 结果与讨论

3.1 从PGA 角度研究对分离速率的影响

3.1.1 PGA用量对分离速率的影响

不同PGA用量对分离速率的影响结果见图2，随着PGA 量的增加，单位时间内悬浮液过滤量明显增加；以分离70 mL 悬浮液的速率大小排序为：3倍酶量＞2倍酶量＞对照，分析原因可能是增大PGA量，提高了PGA与悬浮液的接触面积，使反应体系黏度降低，从而提高了PGA与悬浮液的分离速率。同时提高PGA用量后酶法氨苄西林重量收率都在160%以上，与对照批重量收率161%相当，结合成本，酶量为40 g 较为适宜。

图2 不同PGA用量合成氨苄西林时过滤体积随分离时间的变化Fig.2 The change of filtration volume with separation time in the synthesis of ampicillin with different PGA dosages

3.1.2 PGA粒度对分离速率的影响

在相同PGA活性前提下，使用不同粒度PGA合成氨苄西林。不同PGA粒度对分离速率的影响结果见图3，合成氨苄西林时PGA粒度增大1.5倍左右，PGA与悬浮液分离速率无明显改变；以分离70 mL悬浮液的速率大小排序为：小粒度PGA合成氨苄西林的时间≈大粒度PGA合成氨苄西林的时间，说明在相同PGA活性的前提下，改变PGA粒度，并不能提高PGA与悬浮液分离速率，所以PGA粒度不是影响PGA与悬浮液分离速率的关键因素。

图3 不同粒度PGA合成氨苄西林时过滤体积随分离时间的变化Fig.3 Change of filtration volume with separation time in the synthesis of ampicillin by PGA with different particle sizes

3.2 反应副产物PG对分离速率的影响

结合图1和前期试验数据，可知反应过程中副产物PG 在料液中析出，可能会使体系变得黏稠。故考察反应副产物PG对PGA与悬浮液分离速率的影响。当酶合成工艺路线固定时，生成的PG 量相对固定，所以本试验在反应终点已经生成一定量PG的基础上，通过加入不同重量的PG 来考察其对PGA与悬浮液分离速率的影响。反应副产物PG对分离速率的影响结果见图4，随着PG 量的增加，PGA与悬浮液分离速率下降。以分离50 mL 悬浮液的速率大小排序为：PG 加入量0 g ＞PG 加入量0.2 g ＞PG 加入量0.4g ＞PG 加入量0.6 g。分析原因可能是PG的存在，导致料液黏度较大，不易与PGA 分离，从而影响PGA与悬浮液的分离速率。说明降低PG 量可以提高PGA与悬浮液的分离速率。

3.3 从工艺条件研究对分离速率的影响

3.3.1 不同反应温度对分离速率的影响

图4 反应液中加入不同数量PG 时过滤体积随分离时间的变化Fig.4 Change of filtration volume with separation time when different amounts of PG are added to the reaction liquid

不同反应温度对分离速率的影响结果见图5，随着温度的升高，PGA与悬浮液的分离速率下降；以分离70 mL 悬浮液的速率大小排序为：反应温度10℃、20℃、30℃。结合3.2 部分PG 量对PGA与悬浮液分离速率的影响，分析原因可能是降低反应温度后，降低了反应副产物PG的生成量，从而提高了PGA与悬浮液的分离速率。同时在10℃和20℃时制备的酶法氨苄西林重量收率均在160%以上，与对照批重量收率161%相当，而温度30℃制备的酶法氨苄西林重量收率低于160%，所以反应温度采用10℃较为适宜。

图5 不同反应温度时过滤体积随分离时间的变化Fig.5 Change of filtration volume with separation time at different reaction temperatures

3.3.2 不同反应浓度对分离速率的影响

不同反应浓度对分离速率的影响结果见图6，随着氨苄西林反应浓度降低，PGA与悬浮液分离速率增大；以分离70 mL 悬浮液的速率大小排序为：1/2氨苄西林料液浓度＞2/3 氨苄西林料液浓度＞3/4 氨苄西林料液浓度＞初始氨苄西林料液浓度。结合3.2部分PG 量对PGA与悬浮液分离速率的影响，分析原因可能是降低反应浓度后体系中PG 量也降低，从而提高了PGA与悬浮液的分离速率。同时3/4 氨苄西林料液浓度时制备的酶法氨苄西林重量收率在160%以上，与对照批重量收率161%相当，而2/3氨苄西林料液浓度及1/2 氨苄西林料液浓度时制备的酶法氨苄西林重量收率降至160%以下。说明降低反应浓度可以提高PGA与悬浮液的分离速率，但是会降低收率。

图6 不同反应浓度时过滤体积随分离时间的变化Fig.6 Change of filtration volume with separation time at different reaction concentrations

3.3.3 加入晶种对分离速率的影响

在酶反应阶段加入PGA后，随着反应的进行，氨苄西林晶体析出，本试验考察在氨苄西林晶体析出前加入晶种对PGA与悬浮液分离速率的影响。加入晶种对分离速率的影响结果见图7，在酶反应阶段加入晶种与不加入晶种相比，PGA与悬浮液的分离速率明显提高；以分离70 mL 悬浮液的速率大小排序为：平行试验1 ≈平行试验2 ≈平行试验3 ＞对照批，分析原因可能是加入晶种后诱导析晶，改善了氨苄西林晶型，使氨苄西林晶体容易与PGA 分离。同时这三批平行试验制备的酶法氨苄西林重量收率都在160%以上，与对照批重量收率161%相当，说明晶种的加入可以提高PGA与悬浮液的分离速率。

3.3.4 确定优化工艺

综合以上的研究结论，确定优化工艺条件为：增加酶量、降低反应温度、在酶反应阶段加入晶种的协同作用。

优化组合工艺参数为：在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 纯化水，控制反应温度10℃，加入40 g PGA 开始反应，在反应5 min时加入5%氨苄西林晶种，控制反应过程中pH为5.0～7.5，当6-APA 残留浓度低于10 mmol/L 时为反应终点，停止反应。将PGA 催化合成到达反应终点的氨苄西林悬浮液倒入PGA 分离器，测定PGA与悬浮液的分离速率。

图7 酶反应阶段加入晶种时过滤体积随分离时间的变化Fig.7 Change of filtration volume with separation time when adding crystal seeds in enzyme reaction stage

图8 优化组合时酶分离速率曲线Fig.8 Rate curve of enzyme separation in optimal combination

由图8可知，酶量40 g、反应温度10℃、在酶反应阶段加入晶种的协同作用可以极大程度地提高PGA与悬浮液分离速率。

4 结论与展望

通过从PGA 应用的角度、反应副产物、工艺条件三个方面对PGA 催化合成氨苄西林过程中PGA与悬浮液分离速率的影响因素进行研究，得出：增加酶量、降低反应温度、在酶反应阶段加入晶种的协同作用可以极大程度地提高PGA与悬浮液分离速率。

PGA与悬浮液的分离速率高，在工业生产时有两大优势：一是将PGA 快速地从料液中分离出去，避免PGA的失活；二是使生产工时得到有效地控制，减少料液的降解，保证了产品收率和质量。这不仅为酶法合成氨苄西林的产业化生产提供有力的支持，也为酶法合成其他抗生素时PGA与悬浮液分离研究提供了方向。