芫花素对大鼠产后出血合并MODS氧化应激及凝血指标的影响

柴秀丽，彭 涛，郭富饶，汤 红

(1.重庆市巴南区人民医院 产科，重庆 401320；2.重庆市巴南区人民医院 检验科，重庆 401320)

产后出血(PPH)是当产妇在分娩后24 h之内，出血量超过500 mL的症状。在产科中产后出血最为普遍，因产后出血死亡的人数占所有死亡人数的第一位[1]。引起产后出血的主要有原因是宫缩的乏力所致，在进行手术过程中极易产生应激反应和血液凝结的情况，严重影响产后出血的发生[2]。产妇产后出血极易导致产妇发生休克，各个组织器官会因此发生缺氧缺血，多个器官的功能也会出现不同程度的衰竭，从而导致多器官功能障碍综合征(MODS)的发生[3]。MODS是指患者有严重的创伤和感染发生时，同时或在相对较短的时间内出现两个以上的功能障碍，让机体内的环境发生很大的紊乱，需要靠临床的干预才能继续维持体内平衡的一种综合征[4]。因此，尽早的诊断和治疗产后出血有效防止患者休克合并MODS的发生。目前认为自由基损伤是MODS发生的主要机制，细胞和炎症因子发生失控同时也会导致MODS的发生[5]。临床上在治疗MODS时，通常采用早期的肠内营养和机械性通气等方法，但以上治疗方法并没有有效的降低MODS的死亡率[6]。所以，找到治疗MODS的有效方案，可以很大程度的降低产妇的死亡率。在中药中，益母草是最为传统的一种，主要针对痛经、闭经、产后出血等疾病的治疗，并且效果甚好[7-8]。芫花素是益母草中最为活性的药物，近年来也逐渐应用于成年后出血中，但关于其对MODS产妇机体的应激状态和凝血功能的相关状态报道仍较少[9]。因此，本文建立产后出血合并MODS大鼠模型，对其用芫花素进行干预，并观察芫花素对应激指标和凝血功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验所用大鼠为雌性大鼠35只和雄性大鼠15只，均购自西安交通大学医学部实验动物中心。50只大鼠体重均在190～270 g，所有大鼠自由进食饮水。光照12 h一循环，让所有大鼠在常温下适应3 d新环境。

1.2 试剂和仪器 本实验所有实验试剂和仪器分别是云南西丽生物技术有限公司生产的芫花素；南京建成生物工程研究所生产的丙二醛(MDA)试剂盒、一氧化氮(NO)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒；美国Stoelting公司生产的台式低温离心机；KUBOTA公司生产的冷冻离心机、4 ℃和-80 ℃冰箱；海良平仪器仪表有限公司生产的电子分析天平。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组和模型建立 把所有雌雄大鼠按照2∶1的比例进行合笼过夜，第2天，用显微镜进行观察，当雌鼠的阴道分泌物中有精子或栓子出现时，则证明成功妊娠。成功后把孕鼠分开饲养，当孕鼠生产后24 h内，对大鼠进行实验。没有妊娠成功的大鼠继续进行合笼处理，直到大鼠成功妊娠停止，把不能妊娠的大鼠全部剔除。

所有雌鼠中只有一只大鼠不能成功妊娠，并且在模型建立的过程中有4只大鼠意外死亡。把剩下所有雌鼠一侧的股动、静脉进行分离，将24 g的肝素化用静脉留置针置入股动静脉中。把所有雌鼠平均分为对照组(NC组)，产后出血合并MODS大鼠模型组(MODS组)和产后出血合并MODS大鼠模型加芫花素治疗组(YHS组)。NC组仅进行麻醉，股静脉置管。MODS组、YHS组大鼠从股动脉接动脉换能器，把血液缓慢放出，让所有血液放出的时间大于10 min，并且让大鼠平均的动脉压保持在40～50 mmHg，自身的血液保留用于复苏，当大鼠休克时间在1 h后，把大鼠自体的血液缓慢的输送回大鼠体内，当大鼠的生命体征基本稳定时，半小时后把大鼠的股动静脉分别结扎，把伤口缝合后，让大鼠在单独的笼中进食饮水。在12 h后再次麻醉大鼠，分离大鼠肠系膜上的动脉，并把动脉的根部夹住，40 min后松开后对出血损伤的情况进行检查，缝合腹腔，放回笼中自由喂养。YHS组在产后出血后经股静脉注入芫花素(0.4 mg/kg)干预治疗，NC组和MODS组大鼠均给予等量的生理盐水干预，一天1次，共干预14 d。

1.3.2 标本采集 1 d后，每组大鼠抽取5 mL的腹主动脉血液，加入抗凝素后放置在4℃的环境中冷藏，离心血液后，取其上清液储存。把所有的大鼠分别处死后，取出3组大鼠的右肺上叶和小肠缺血再灌注段，把组织放置在-80 ℃的冰箱中保存。

1.3.3 氧化应激指标测定 把大鼠的腹主动脉血取出后，离心取其上清液，分别对大鼠血清中的MDA、NO、SOD、GSH和CAT指标进行测量。

1.3.4 凝血指标检测 在大鼠空腹时，抽取大鼠腹主动脉血后加入抗凝素，对大鼠的凝血指标进行检测。分别为TT、PT、APTT、Fib、D-D和AT。

1.3.5 血清中TNF-α和IL-6浓度的测定 给药结束后，取所有大鼠的肘静脉血，离心后取上清液，检测说那组大鼠血清中炎性因子TNF-α和IL-6的浓度。分别检测3次，取3次结果的平均值，实验的所有步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.6 检测肺组织病理学形态变化 分别处死NC组、MODS组和YHS组大鼠，把3组大鼠的肺组织分别取出，把肺组织固定于甲醛溶液中，24 h后对大鼠的肺组织进行切片处理，保证切片的厚度为4 μm，脱蜡后进行HE染色并进行观察。

1.3.7 Western blot检测大鼠TNF-α和IL-6蛋白表达 分别取3组大鼠100 mg的肺组织，把肺组织裂解后，提取总的核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在零-20 ℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均，按照4∶1的比例进行，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。在电泳板内分别注入50 μm的蛋白样品，把蛋白样品进行电泳处理，转移组织到PVDF膜上，在组织中加入脱脂奶粉后封闭，总封闭1 h。把1抗加入其中，用TTBS溶液进行漂洗，每次漂洗10 min，一共进行3次漂洗，最后加入2抗对溶液进行稀释，室温下再次封闭，总时长1 h。把PVDF膜取出后，再次用TTBS溶液进行漂洗，10 min一次，共漂洗3次后，用DAB溶液进行显色处理，相机拍照。

2 结果

2.1 3组大鼠的氧化应激指标比较 和NC组大鼠MDA和NO相比较，MODS组大鼠明显升高，而SPD、GSH和CAT显著低于NC组(P<0.05)；和MODS组大鼠相比较，芫花素干预后的YHS组大鼠的MDA指标显著降低，SOD、GSH和CAT指标得到显著的改善(P<0.05，见表1)。

表1 3组大鼠血清中氧化应激指标含量

2.2 3组大鼠凝血指标比较 和NC组TT、PT、Fib和D-D指标相比较，MODS组大鼠显著增高(P<0.05)，而MODS组大鼠的APTT和AT指标显著低于NC组大鼠(P<0.05)；和MODS组大鼠相比较，YHS组大鼠的TT和PT的时间显著缩短，并且Fib和D-D指标明显降降低(P<0.05)，而YHS组大鼠的APTT和AT指标显著高于MODS组大鼠(P<0.05，见表2)。

表2 3组大鼠凝血指标比较

2.3 3组大鼠血清中炎性因子TNF-α和IL-6含量的比较 和NC组的炎性因子TNF-α和IL-6的含量相比，MODS组都显著增加，而YSH组大鼠的炎性因子明显得到了显著的降低(P<0.05，见表3)。

表3 3组大鼠血清中炎性因子TNF-α和IL-6含量的比较

*：与NC组比较，P<0.05；#：与MODS比较，P<0.05。图1 TNF-α和IL-6含量的比较

2.4 3组大鼠肺组织形态变化比较 和NC组大鼠相比，MODS组大鼠肺组织炎性损伤明显，血管周围、各级支气管周围以及管腔内均由不同程度的炎性细胞浸润，在严重的病灶区，肺泡腔和支气管腔都被炎性细胞浸润，泡腔或官腔消失，完全变实，多处肺泡壁破裂，损坏的肺泡融合成大的腔体。和MODS组相比，YHS组大鼠的情况明显好转，见图2。

A：NC组；B：MODS组；C：YSH组。图2 3组大鼠肺组织HE染色结果(×200)

2.5 Western blot检测大鼠TNF-α和IL-6蛋白比较 和NC组TNF-α和IL-6蛋白相比，MODS组显著增多(P<0.05)；而JHS组的蛋白表达显著降低(P<0.05，见图3、4)。

图3 3组大鼠TNF-α和IL-6蛋白表达

*：与NC组比较，P<0.05；#：与MODS比较，P<0.05。图4 3组大鼠TNF-α和IL-6蛋白比较

3 讨论

在急性损伤24 h后，机体内同时出现两个或多个器官功能的损害或衰竭的情况称为MODS[10-11]。但产科发生MODS时，其发病的因素一般都相对较急，例如子痫和先兆子痫、产科出血后休克等，继发性受到损伤的部位和原发性损伤的部位相隔较远，并且该疾病的来势非常凶猛，同时有较高的病死率。导致产科MODS的主要原因之一是产后出血，在预防产后出血时，主要是让子宫的收缩功能加强，目前用于加强子宫收缩功能的常用药物为宫缩素。宫缩素在治疗时虽然起效较快，但对于病情的维持时间相对较短，需要多次给予宫缩素才能让药效进行基本的维持；在使用宫缩素时，不同的个体都具有很大的差异性，有很多的患者对宫缩素的治疗效果并不理想，当大剂量使用使，很多患者会出现呕吐和血压升高的情况[12]。所以，需要开发新的临床药物来治疗产后出血的情况。近年来，学者们对益母草的研究很多，发现其对子宫收缩功能很好的促进作用，并且也已经有学者将其用于治疗产后出血。芫花素是从益母草中提取出来的，也是最活跃的成分之一，所以本文采用芫花素对产后出血导致的MODS的大鼠进行干预，并观察其对氧化应激指标和凝血情况的影响。

氧化和抗氧化的系统在正常人的机体内会始终保持相对的平衡，当机体内的这种平衡被打破时，就会产生大量的炎症因子和氧自由基，他们会对机体造成一定的损伤。氧化应激反应是指活性氧自由基和抗氧化的系统的平衡被打破，氧化应激发生时组织也会不同程度的发生损伤[13]。抗氧化剂SOD对超氧化物自由基和氢离子的反应有一定的催化作用，同时会产生大量的过氧化氢。CAT属于一种酶类的清除剂，对过氧化氢强分解有明显的促进作用，同时把体内的过氧化氢清除掉，从而抑制过氧化氢导致的机体损害[14]。GSH属于一种抗氧化剂，不仅能让蛋白分子中的巯基免不受到氧化反应，还能对其酶和蛋白的活性进行保护。本文研究结果发现，MODS组大鼠的SOD、GSH和CAT的水平显著低于NC组大鼠，YHS组大鼠的指标得到显著的改善。酶类抗氧化剂的活性可由芫花素来进行提高，其所具有的抗氧化能力能有效的减少产后出血合并的MODS所造成的氧化应激损伤。抗氧化的标志物之一就是MDA，脂质的过氧化可依靠MDA来实现，并且增加粘膜的通透性，增强细胞的活性，从而产生大量的组织细胞。NO是在细胞内参与着细胞的死亡，当机体出现缺血时，NO会大量的产生，并且NO会和超氧化物进行反应，形成具有超氧化作用的氧化剂ONOO，其所具有的高活性成分会和细胞中的一些成分相结合，从而导致功能发生障碍。本研究结果显示，MODS组大鼠的MDA和NO指标均比NC组大鼠升高，而YHS组大鼠的MDA和NO指标显著降低。可见，芫花素可降低产后出血合并MODS大鼠的MDA的水平，NO的产生也会受到抑制，从而减少组织的脂质过氧化反应。

引起产科凝血功能障碍的常见病因有产后出血和感染等，当严重的产后出血未得到及时控制，出现休克、酸中毒时，组织器官会因此而出现缺血和缺氧的情况，血管的内皮组织受到损伤时，凝血因子Ⅻ会被激活，这时也重新启动了体内的内源性凝血系统[15-16]。患者进行大量的输血时，体内的凝血因子含量也大量的减少，或者当输入不同血液而发生的溶血反应时，凝血系统就会被激活，甚至让血小板发生间接的损伤，进而发生凝血功能的障碍[17]。在进行常规的凝血指标检测时，TT、PT、APTT和Fib是最常用的指标，在对出血疾病进行判断时，其也是重要的依据。D-D是交联纤维蛋白的特异性降解产物，当D-D出现异常的升高时，体内的高凝状态就会被反应出来；AT主要是由肝脏那个和内皮细胞共同合成的，会一定程度的抑制各种凝血因子，在人体的抗凝中也有非常重要的作用，同时也是临床评估高凝状态的重要指标[18]。本研究结果发现，和NC组TT、PT、Fib和D-D指标相比较，MODS组大鼠显著增高(P<0.05)，而MODS组大鼠的APTT和AT指标显著低于NC组大鼠(P<0.05)；和MODS组大鼠相比较，YHS组大鼠的TT和PT的时间显著缩短，并且Fib和D-D指标明显降降低(P<0.05)，而YHS组大鼠的APTT和AT指标显著高于MODS组大鼠(P<0.05)。益母草的有效成分为益母草碱和益母草素，他们的作用类似于垂体后叶激素，促进子宫收缩，增加子宫张力等作用。对产后或流产后因子宫收缩不良而引起的出血有一定治疗作用。由此可见，益母草的主要成分芫花素对产后出血也能进行有效的抑制。文献显示，在炎症介子和细胞因子等不同的病理作用下，机体凝血C纤溶的平衡对受其而发生改变，同时血小板的功能也会因此而发生紊乱，从而导出血和凝血的情况出现。缓激肽会受到凝血瀑布出发后正反馈的刺激，大量的炎性介质也会不同程度的增加，会有出血、休克等情况的发生，从而让凝血功能发生障碍和多器官的功能发生障碍。

TNF-α主要是由被激活的巨噬细胞产生，是最早产生的促炎细胞因子之一，能诱导IL-6等炎症的分泌，促发炎症反应，其水平增长可反应患者肺组织损伤的程度。本文研究发现，MODS组大鼠的炎性因子显著高于NC组，并且该组肺组织明显发生了改变，该组大鼠肺组织炎性损伤明显，血管周围、各级支气管周围以及管腔内均由不同程度的炎性细胞浸润，在严重的病灶区，肺泡腔和支气管腔都被炎性细胞浸润，泡腔或官腔消失，完全变实，多处肺泡壁破裂，损坏的肺泡融合成大的腔体。而YHS组大鼠的炎性因子得到了显著的降低，同时肺组织的病理变化明显好于MODS组(P<0.05)。蛋白比较发现，和NC组TNF-α和IL-6蛋白相比，MODS组显著增多(P<0.05)；而JHS组的蛋白表达显著降低(P<0.05)。提示，芫花素可抑制MODS大鼠的炎性因子，对肺组织中TNF-α和IL-6蛋白会一定程度的降低。有学者发现，芫花素具有一定的抗炎活性，清除自由基，抑制肿瘤活性等病理作用。戴素蓉等[19]研究发现，益母草可明显增加产后出血患者的凝血功能。樊江波等[20]研究证实，小鼠的凝血功能可通过芫花素进行促进，并且小鼠的疼痛也会一定程度的减轻，抑制耳廓肿胀的同时对小鼠腹腔的毛细血管通透性有一定的降低作用，并且能有效抵抗炎性因子。

综上所述，大鼠产后出血合并的MODS的氧化应激损伤可由芫花素进行抑制，并且有效提高其凝血功能。