HPV E6/E7mRNA检测联合TCT在宫颈癌及癌前病变筛查中的临床意义

尹 莉，杨晓荣，喻永林，王 凯，杜勇军，郑 洪

(1.遵义医科大学附属医院 病理科，贵州 遵义 563099；2.德江县人民医院，贵州 德江 565200)

宫颈癌是女性生殖系统恶性肿瘤中发病率最高的种类[1]，其致死率不容忽视。研究表明90%以上的宫颈癌发生伴随着HPV的高危型持续感染[2-6]。临床常用的宫颈癌筛查方法分为细胞学筛查和病毒学筛查两类，它们各有优劣。细胞学筛查目前的主流方法为TCT，敏感性、特异性较传统方法(巴氏涂片)得到很大程度的提升[7-8]。但因其主观性较强，受诊断医生的临床经验和观念等因素影响而致诊断结果重复性不高。病毒学检查方法包括HPV DNA和HPV RNA检测。近年来HPV RNA检测被广泛应用于临床宫颈癌筛查，其敏感性低于HPV DNA，特异性高于HPV DNA，是反映HPV活动程度的可靠依据[9]。现有的各类宫颈病变筛查方法存在敏感性和特异性的矛盾，重复性较差，找到更好的筛查方法仍是需要探讨的问题。本研究我们将结合病毒学和细胞学检测方法，探讨TCT和HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈病变筛查中的作用，为寻找更好的临床筛查方法提供了科学理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源 收集2018年6月至2019年6月于遵义医科大学附属医院进行宫颈癌及癌前病变筛查的304例病例资料进行回顾性分析。纳入标准：性生活史；因接触性出血、白带增多或异常、外阴瘙痒或者无症状进行常规筛查，行TCT、HPV E6/E7 mRNA检测及阴道镜下宫颈活检。排除标准：患者近3个月有妊娠史、严重肝肾疾病史、血液病史、子宫切除史。受检者年龄19～71岁，平均(42.45±11.20)岁。本项临床研究为回顾性研究，仅采集患者临床资料，不干预患者治疗方案，不会对患者生理带来风险，研究者会尽全力保护患者提供的信息，不泄露个人隐私，已申请免除知情同意。

1.2 方法 所有研究对象均常规刷取宫颈鳞柱交界脱落细胞放入对应的保存液中，洗脱细胞后盖紧，贴好标签后进行TCT及HPV E6/E7 mRNA检测。TCT检查要求制成单层细胞涂片，对其进行常规的染色和固定，按照检查标准要求的专用仪器进行细胞学诊断。HPV E6/E7 mRNA检测通过美国豪洛捷公司Panther系统进行。其中一项异常或临床高度怀疑宫颈病变者，经患者同意后行阴道镜下可疑病变处宫颈活检或常规宫颈3、6、9、12点取材，进一步进行组织病理学检查。按照组织病理学检查结果分为炎症组、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)组、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组和宫颈癌组，讨论TCT和HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈癌前病变及宫颈癌的筛检作用。

1.3 结果判定 (1)HPV E6/E7 mRNA为美国豪洛捷公司生产的对宫颈癌14型(包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)高危型HPV的检测，其针对高致癌风险的3种HPV亚型16，18，45的分型，通过全自动一体化分子诊断平台Panther进行结果判读， HPV E6/E7 mRNA结果如下：16型阳性、18/45型阳性、其它11型阳性及阴性。(2)TCT诊断遵循Bethesda系统(2014)[10]：包括未见上皮内病变或恶性病变(Negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM)、意义不明确的非典型性鳞状细胞(Atypical squamous cell of undetermined significance，ASC-US)、非典型性鳞状细胞，不能除外高度鳞状上皮内病变(Atypical squamous cell，cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion ，ASC-H)、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)、宫颈癌(CC)。本研究定义TCT阳性为TCT≥ASC-US。(3)组织病理学由高年资病理医生阅片，诊断遵循WHO女性生殖器肿瘤分类[11](2014)：包括宫颈炎，不伴鳞状上皮内病变；LSIL，即原CIN1；HSIL，即原CIN2、CIN3以及原位癌；宫颈癌，即宫颈浸润性癌(见图1)。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析，计数资料以百分比描述，组间差异性比较采用χ2检验，P<0.05，差异有统计学意义，同时两两进行比较，采用Pearsonχ2检验进行校正。约登指数(Youden index，YI)比较其诊断一致性及准确性。

A：宫颈炎，不伴鳞状上皮内病变；B：LSIL；C：HSIL； D：宫颈浸润性癌;HE,观察倍数均为×200。图1 宫颈组织病理学检查结果

2 结果

2.1 筛查结果 304例病例均完成TCT、HPV E6/E7 mRNA检测以及阴道镜下组织病理学活检，并以组织病理学诊断为标准进行分组，炎症组144例，LSIL组46例，HSIL组100例，宫颈癌组14例，炎症组认定为非宫颈病变，其余组均认定为发生了宫颈病变。

2.1.1 HPV E6/E7 mRNA检测及TCT在不同组织病理学结果的阳性率(%)比较(见表1) 304例患者TCT在各病理分组中的阳性率为炎症组29.9%、LSIL组45.7%、HSIL组61.0%及宫颈癌组78.6%，进行两两比较，LSIL组、HSIL组及宫颈癌组的阳性率均大于炎症组，P均<0.05；宫颈癌组大于LSIL组，P<0.05。

HPV E6/E7 mRNA检测在各病理分组中的阳性率为炎症组52.8%、LSIL组91.3%、HSIL组94.0%及宫颈癌组92.9%，进行两两比较，LSIL组、HSIL组及宫颈癌组均大于炎症组，P均<0.05。

炎症组、LSIL组、HSIL组及宫颈癌组4组中HPV E6/E7 mRNA阳性率均大于同组TCT阳性率，炎症组、LSIL组、HSIL组，P均<0.05。

表1 TCT、HPV E6/E7 mRNA检测在组织病理学各组病例中的阳性率(%)情况

2.1.2 HPV E6/E7 mRNA各亚型在各组中的阳性率(%)情况(见表2) HPV E6/E7 mRNA检测16型阳性率随宫颈病变程度加重而上升，18/45型阳性率与宫颈病变程度无明显相关性，其他11型阳性率随宫颈病变程度加重而下降。

HPV E6/E7 mRNA检测16型阳性病例在各病理分组中的阳性率为炎症组(15.8%)

HPV E6/E7 mRNA 检测18/45型阳性病例在各病理分组中的阳性率为炎症组11.8%、LSIL组11.9%、HSIL组6.4%及宫颈癌组7.7%，进行两两比较，P均>0.05。

HPV E6/E7 mRNA检测其他11型阳性病例在各病理分组中的阳性率为炎症组(72.4%)>LSIL组(69.0%)>HSIL组(57.4%)>宫颈癌组(15.4%)，进行两两比较，HSIL组、宫颈癌组分别与炎症组比较，P<0.05；宫颈癌组分别与LSIL组、HSIL组比较，P均<0.05。

HPV E6/E7 mRNA检测16型、18/45型及其他11型在各病理分组中阳性率，进行两两比较，炎症组、LSIL组：16型>18/45型，P>0.05，16型、18/45型均<其他11型，P均<0.05；HSIL组：其他11型>16型>18/45型，P均<0.05；宫颈癌组：16型>18/45型，16型>其他11型，P均<0.05。

表2 HPV E6/E7 mRNA检测分型在组织病理学各组病例中的阳性率(%)情况

2.1.3 TCT、HPV E6/E7 mRNA检测及两者联合应用诊断效能分析(见表3) TCT诊断宫颈病变(≥LSIL)特异性(70.1%)大于HPV E6/E7mRNA检测(47.2%)，P<0.05；HPV E6/E7 mRNA检测诊断宫颈病变(≥LSIL)敏感性(93.1%)大于TCT(58.1%)，P<0.05；TCT、HPV E6/E7 mRNA检测两者联合(任何一项阳性即为阳性)诊断宫颈病变(≥LSIL)敏感性及特异性分别为98.1%、45.1%，其敏感性明显高于单独应用，虽然特异性有所下降，但是联合应用约登指数(0.432)高于单独使用(TCT0.283、HPV E6/E7 mRNA检测0.403)。

表3 TCT、HPV E6/E7mRNA在宫颈病变(≥LSIL)中诊断效能情况

2.2 TCT诊断为NILM、ASC-US、ASC-H病例中病理分组及HPV E6/E7 mRNA检测表达(%)情况(见表4)

2.2.1 TCT诊断为NILM病例中病理分组及HPV E6/E7 mRNA检测表达情况 TCT诊断为NILM病例168例，其中HPV E6/E7 mRNA检测阳性107例，组织病理学诊断为≥LSIL病例59例：包括LSIL22例，HSIL35例，宫颈浸润性癌2例； HPV E6/E7 mRNA检测阴性61例，组织病理学诊断为炎症53例，LSIL3例，HSIL4例，宫颈浸润性癌1例。TCT诊断为NILM，组织病理学被证实为LSIL及以上者共67例，经再次阅片发现有17例可见少量异型细胞，2例可诊断为HSIL。

2.2.2 TCT诊断为ASC-US病例中HPV E6/E7 mRNA检测表达情况 TCT诊断为ASC-US病例45例，HPV E6/E7 mRNA检测阳性36例，组织病理学诊断为≥LSIL病例19例：包括LSIL6例，HSIL10例，宫颈浸润性癌3例；HPV E6/E7 mRNA检测阴性9例，组织病理学诊断为炎症9例。

2.2.3 TCT诊断为ASC-H病例中HPV E6/E7 mRNA检测表达情况 TCT诊断为ASC-H病例19例，HPV E6/E7 mRNA检测阳性17例，组织病理学诊断为≥LSIL病例15例：包括LSIL3例，HSIL10例，宫颈浸润性癌2例；HPV E6/E7 mRNA检测阴性2例，组织病理学均诊断为炎症。

表4 TCT为NILM、ASC-US、ASC-H病例各病理分组中HPV E6/E7mRNA检测表达(%)情况

2.3 炎症组中HPV E6/E7 mRNA检测表达情况与组织形态学改变的关系 组织病理学诊断为炎症而HPV E6/E7 mRNA检测表达阳性病例76例，其中伴表面鳞状上皮轻度增生11例，伴腺体鳞化35例，且细胞核染色较阴性者深、大，染色质稍粗；HPV E6/E7 mRNA检测阴性68例，其中伴表面鳞状上皮轻度增生3例，伴腺体鳞化13例。

3 讨论

80%的人一生中会感染HPV，然而90%的感染者两年内通过自身免疫而自动清除HPV[12]，即出现一过性感染，仅有少部分人会进一步进入持续感染从而发生宫颈病变甚至宫颈癌。研究表明高达90%低级别宫颈上皮内病变可消退，60%高级别宫颈上皮内病变可消退[13]。临床常用的筛查方法有细胞学和病毒学筛查两大类。如前所述，细胞学检查的主流方法为TCT，病毒学检查方法包括HPV DNA及HPV RNA检测。机体感染HPV后，被识别到的HPV可以被机体自身免疫(包括体液免疫、细胞免疫)所清除，而未被清除的HPV则可以通过合成颗粒分子而使得HPV的生命周期处于被保护状态而不被细胞溶解酶溶解，也可以通过与宿主DNA整合而持续表达E6、E7 mRNA，进一步合成E6、E7蛋白，却逃避免疫系统的监测[14]。E6、E7蛋白高表达并抑制抑癌基因P53、Rb的表达，激活人端粒酶逆转录酶活性而导致细胞永生化、不受控制的复制最终导致宫颈病变甚至宫颈癌的发生、发展[15]。因此，针对HPV E6/E7 mRNA的检测应当是区分宫颈潜在恶性病变的重要方法。2012年美国癌症学会、美国阴道镜检查与子宫颈病理学会(American society for colposcopy and cervical pathology，ASCCP)和美国临床病理学学会(American society for clinical pathology，ASCP)联合发布一项指南[16]，明确规定30～65岁女性应每5年接受1次HPV检测和细胞学检查联合筛查宫颈癌。

本研究针对进行了TCT、HPV E6/E7 mRNA检测以及两者联合(串联)检测的304例病例进行了讨论和分析。TCT、HPV E6/E7 mRNA检测以及两者联合检测阳性率均随着病理分组级别升高而呈上升趋势，该结论也从Rijkaart[17]、Ratman[18]等的研究结果中得到佐证。此外，在本研究中HPV E6/E7 mRNA检测阳性率宫颈癌组低于HSIL组，可能的原因是本研究中宫颈浸润性癌标本较少，未能全面反映出宫颈癌组的情况。

单独使用TCT、HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈癌及癌前病变筛查中均起到一定的作用：TCT对宫颈疾病诊断特异性(70.1%)较高，但敏感性(58.1%)欠佳，约登指数(0.283)，研究中显示在TCT诊断为NILM病例中经过再次阅片发现有17例可见少量异型细胞，2例可以诊断为HSIL，表明TCT存在一定程度的漏诊，易受到标本质量及主观因素的影响；而HPV E6/E7 mRNA检测敏感性(93.1%)较高，特异性(47.2%)较低，约登指数(0.403)。当HPV E6/E7 mRNA检测联合TCT应用后敏感性高达98.1%，虽然与此同时降低了特异性(45.1%)，但是其约登指数(0.432)有所提升，表明联合应用可以提高其与宫颈病变的一致性[19]。在TCT诊断为可疑病变(ASC-US、ASC-H)病例中，结合HPV E6/E7 mRNA检测阳性及阴性结果可以更好的利于病人的分流管理，HPV E6/E7 mRNA检测阳性(尤其是16型阳性)则进一步行阴道镜下活检，阴性则定期复查。既可以弥补在病变初期TCT的低敏感性，避免假阴性带来的风险，还可以浓缩进一步做阴道活检的病例，并将不同级别的宫颈癌及癌前病变有效地从中筛查出来，增加诊断的可信度，降低漏诊率[20]。

本研究还对炎症组中HPV E6/E7 mRNA表达情况与组织形态学改变做了进一步剖析，发现表达阳性病例中伴有鳞状上皮增生及腺体鳞化的比例(46/76，60.5%)高于阴性(16/65，23.5%)，且其细胞核改变更明显，表明阳性表达病例更易发生宫颈病变。

综上所述，HPV E6/E7 mRNA检测及TCT对宫颈癌及癌前病变都有一定的筛检率，二者联合应用时显著提高了敏感性，同时其诊断与金标准的一致性得到了提升。因此联合TCT和HPV E6/E7mRNA检测更适合作为监测预警指标，更能及时发现早期宫颈癌及癌前病变，进行早期治疗，预防病情进一步发展。