周围神经损伤修复过程以及miRNA在周围神经修复中的研究进展

蒋玲丽，魏在荣

(遵义医科大学附属医院 烧伤整形外科， 贵州 遵义 563099)

据统计，全球每年因车祸伤、机器绞伤等导致周围神经损伤的患者数量高达百万，且发病率有逐年上升的趋势[1]。周围神经损伤(Peripheral nerve injuries，PNI)导致其支配区域的感觉及运动功能丧失，严重影响了患者的生活质量。截至目前，临床上治疗PNI的方法主要有神经断端吻合术、自体神经转位或移植术、神经套接管、组织工程材料、干细胞治疗以及促神经生长因子注射治疗等。由于神经显微吻合术后易形成吻合口瘢痕或吻合不佳导致神经断端神经瘤形成，神经套接管以及组织工程材料价格昂贵、组织相容性不佳、疗效不确定等因素，目前临床修复神经缺损最佳的治疗方式仍然是自体神经转位或移植，但是自体神经来源有限且神经供区并发失神经症状，所以，目前已有的治疗方法在临床仍存在很大应用局限性[2-5]。所以，在临床工作中迫切于寻找一种新的有效的周围神经修复方案。

PNI再生是一个十分复杂的过程，随着对周围神经损伤修复机制研究的不断深入，发现PNI修复再生过程受到诸多关键因子及通路的调控，而了解这些因素的调控机制就很可能找到新的临床治疗靶标，通过干预调控因素从而加速周围神经修复再生。因此，研究PNI修复过程中关键调控因子及其调控机理，针对神经修复机制开发新型药物，对提高PNI治疗效果及改善患者的生存质量具有重要意义。

1 PNI修复再生过程

PNI再生主要经历了神经断端华勒变性、修复雪旺细胞形成和“神经桥”形成三个重要过程(见图1)。

图1 PNI主要修复过程及miRNA的调控作用

1.1 华勒变性 华勒变性是PNI修复再生的基础[6]。周围神经损伤后不久，神经远节断端由于丧失胞体营养支持而变性、解体，髓鞘及轴突破坏，即发生华勒变性。此时清除损伤部位的髓鞘及轴突碎片刻不容缓，顺利清除髓鞘及轴突碎片可以为轴突再生创造合适的微环境，而碎片清除不佳则可能触发炎症性免疫反应，从而损害神经元以及延缓轴突再生过程。在华勒变性过程中，神经断端雪旺细胞 (Schwann cells,SC)将在分子及细胞水平发生广泛的变化，产生独特的表型，即形成修复雪旺细胞[7]。修复雪旺细胞是一种具有较强再生能力的祖细胞样细胞，主要有维持受损神经活性、支持神经再生等功能[8-10]。修复雪旺细胞形成后通过在局部以引发髓鞘自噬、募集巨噬细胞等方式清除髓鞘及轴突碎片[8]，联合损伤部位的巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等形成引导轴突再生的“神经桥”(Bungs of Büngner)，引导轴突重新支配靶目标同时表达诸多关键的再生相关细胞因子，例如神经元生长因子(Neuronal growth factors)和细胞粘附因子(Cell adhesion molecules)[8,11]，为轴突再生创造适宜的微环境。

1.2 修复雪旺细胞形成 修复雪旺细胞的形成受诸多机制的调节，主要是与髓鞘形成相关基因的下调和损伤特异性基因表达程序的上调。未成熟的雪旺细胞向有髓细胞的转化取决于前髓鞘素基因调节蛋白(Promyelin gene regulatory proteins)，包括Krox-20、Nab1和2、Oct-6、Brn2、NFκB和Sox-10等，而雪旺细胞髓鞘化主要取决于锌指转录因子Krox-20(Egr2)和其他一些轴突信号激活的前髓磷脂转录因子[12-15]。髓鞘形成的雪旺细胞有很强的可塑性，在神经受损或者发生脱髓鞘病变时，它可以去分化为祖细胞样细胞，在此过程中，亮氨酸拉链蛋白c-Jun作为主要调控者[13]。在正常生理过程中，c-Jun通过Krox-20或环磷酸腺苷(cAMP )抑制髓磷脂基因的活化，当神经损伤时，c-Jun和Krox-20表现出交叉拮抗功能关系，调控有髓雪旺细胞去分化为祖细胞样细胞[10]。c-Jun存在于未成熟的雪旺细胞中，其表达被Krox-20抑制，而在共培养过程中过表达c-Jun时髓鞘化受到抑制，因此在雪旺细胞开始髓鞘化时c-Jun的表达水平很低。PNI后雪旺细胞去分化重新进入细胞周期，c-Jun及磷酸化c-Jun的表达迅速上调，雪旺细胞表现为去分化及增殖；而当外源性使用db-cAMP诱导雪旺细胞髓鞘化时，c-Jun和磷酸化c-Jun被抑制[16-17]。所以在周围神经损伤修复过程中，c-Jun首先上调以促断端SC去分化为祖细胞样细胞并增殖，随着修复进程的进行，c-Jun下调，而Krox-20等促雪旺细胞髓鞘化因子开始上调，促雪旺细胞髓鞘化进而促进PNI修复。

1.3 “神经桥”形成 在“神经桥”形成前，两断端之间神经碎片的清除十分必要，而巨噬细胞在这个过程中扮演着“清道夫”的作用，主要功能是参与髓鞘及轴突碎片的清除，促进神经桥形成。PNI后，局部微环境缺氧刺激以及去分化SC募集到损伤局部的巨噬细胞联合局部常驻巨噬细胞[18]对PNI迅速做出反应[19-21]。CCL2是单核细胞的主要趋化因子，它与受体CCR2以高亲和力结合[22-23]，在神经中，CCL2主要在雪旺细胞中表达，CCR2主要在单核细胞和巨噬细胞表达，而巨噬细胞和嗜中性粒细胞在清除髓磷脂和轴突碎片中起主要作用[24]。神经损伤后，在损伤局部检测到CCL2 mRNA增加，随后在整个神经远端残根中高表达，随着雪旺细胞高表达CCL2，巨噬细胞不断被募集到损伤局部，并于3天左右达到峰值。巨噬细胞对髓磷脂的吞噬清除主要是调理素途径CR3(补体受体3)和非调理素途径SRA(清道夫受体-AI / II)[6]：变性的髓磷脂激活补体系统后产生补体蛋白C3bi后，CR3可通过C3bi与C3bi调理过的髓磷脂结合，从而清除变性的髓磷脂，而SRA作为非调理素受体，可直接结合未经调理的髓磷脂对髓磷脂进行清除。据近期研究，CX3CR1依赖性巨噬细胞浸润到损伤神经中，释放出含有可产生活性氧的酶的外泌体，神经元轴突内吞并将这些外泌体逆行转运至神经胶质，在神经元细胞体释放出活性氧，这些分子氧化并使磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)失活，从而激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号通路(Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway)，由此促进周围神经的再生[25]。另外，在秀丽隐杆线虫中，在巨噬细胞上表达基因ced-1(ced代表细胞死亡异常)编码一种跨膜清除剂受体(该受体在无脊椎动物和脊椎动物之间高度保守)，当死亡细胞或轴突碎片发出吞噬信号时，巨噬细胞表面受体激活后启动信号通路对轴突碎片等“垃圾”进行清除[26]。

PNI后神经两断端之间形成的“神经桥”(“Bungs of Büngner”)是引导轴突再生重新支配靶组织的桥梁。PNI后，神经断端SC去分化为祖细胞样细胞，发出信号募集血液中巨噬细胞至损伤部位，同时局部常驻巨噬细胞激活，巨噬细胞感受到损伤局部的缺氧信号。在PN横断第2天左右，损伤部位巨噬细胞(50%)和嗜中性白细胞(24%)以及成纤维细胞(13%)和内皮细胞(ECs)(5%)初步形成一个半透明的“神经桥”[19]。巨噬细胞分泌的VEGF-A诱导形成的极化血管是周围神经再生过程中引导SC及轴突准确重支配靶目标的基础[27]。为了缓解局部缺氧，神经桥巨噬细胞的转录因子HIF-1α表达增加并启动转录反应，上调促血管生成因子(例如VEGF-A)，而VEGF是ECs强烈有效的引诱剂，故桥中巨噬细胞通过分泌VEGF-A，能够使ECs聚集到两神经断端，触发神经桥区域的血管极化，进而形成神经桥极化血管内皮支架，该支架可以引导雪旺细胞索从神经残端以“出芽”的方式爬出，并有方向性的穿过神经桥。研究证实TGFβ信号传导与SC增殖、凋亡和髓鞘形成的调节有关[28]，在雪旺细胞沿神经桥迁移过程中，TGFβ通过上调EphB2而介导EphB2效应物N-钙粘蛋白(它也是TGFβ靶标)的表达，从而使雪旺细胞索能沿着神经桥定向移动，而在缺乏TGFβ信号传导的情况下，N-钙粘蛋白表达降低将会导致SC索及其伴随再生的轴突混乱迁移，导致周围神经修复重建失败。雪旺细胞索沿神经桥爬行后形成一个中空的管腔，再生轴突沿着这条管腔再生，最终准确重支配其靶目标。

2 miRNA在PNI修复中的作用

miRNA在PNI修复过程中发挥着重要的调控作用[29](见图1)。研究发现PNI后miR-340通过直接靶向组织纤溶酶原激活剂(tPA，有降解基质分子和细胞粘附分子的能力)的3'-UTR以调控tPA的表达，从而调节细胞碎片的清除及轴突再生[30]。PNI后轴突或神经末梢分泌出大量miRNA指导雪旺细胞的迁移， miR-9，miR-221，miR-222和miR-182可以调节SC的增殖和迁移，其中miR-221-3p通过下调SCs髓鞘形成所必需的NGF1-A结合蛋白1(Nab1)，抑制SCs髓鞘形成而促进SCs的增殖及迁移[31]；miR-221 / 222可显著促进PNI后髓鞘再生过程以促进神经再生[32]。PNI后周围神经miR-222通过部分沉默PTEN的表达进而促进DRG神经元的神经突向外生长[33]；Let-7 miRNA通过直接靶向神经生长因子(NGF)并抑制其蛋白翻译，从而显著降低SCs的细胞增殖和迁移，而在PNI的早期应激反应中let-7 miRNA通过非NGF依赖途径抑制SC凋亡[34]。miR-138是神经系统中高度表达的miRNA，其作为分子阻遏物来调节发育和再生过程中轴突的生长，而NAD依赖的组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)SIRT1为miR-138下游的分子靶标，SIRT1又作为转录阻遏物直接抑制miR-138的表达从而促进哺乳动物轴突再生，故miR-138和HDAC SIRT1之间形成相互负反馈的回路调控轴突再生过程[35]。miR-192-5p抑制作用通过上调X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达，减少神经细胞凋亡并增加神经修复因子的表达以促进周围神经损伤的修复和再生[36]。PNI后上调miR-sc14可以促进雪旺细胞的增殖和迁移，所以有研究提出miR-sc14可能是促进周围神经损伤修复的干预靶标[37]。

3 外泌体miRNA在PNI修复中的作用

近年来，越来越多研究表明外泌体在细胞间通讯中起到关键作用，外泌体[38-40]及其内富含的miRNA参与调控多种细胞途径，包括血管生成，细胞转运，细胞凋亡等过程[41-42]。研究表明外泌体携带的miRNA在神经修复过程中发挥着重要的作用[43](见图2)。在PNI修复过程中，微环境中的雪旺氏细胞、巨噬细胞和间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells，MSCs)等细胞会通过外泌体携带的miRNA加速周围神经损伤修复，促进周围神经功能恢复[43-44]。研究发现雪旺氏细胞外泌体miR-340可以调控损伤的神经碎片清除和轴突再生[30]；而miR-221/222在周围神经修复过程中可以通过靶向LASS2基因调控雪旺氏细胞的迁移和增殖，并诱导雪旺氏细胞表型改变[45]。M2型巨噬细胞外泌体miR-223通过上调神经生长因子和层粘连蛋白表达促进雪旺氏细胞迁移和增殖，进而加速周围神经修复[46]。MSCs外泌体miR-17-92簇通过调控PTEN/mT1OR通路促进轴突生长，并且可以增强神经可塑性和功能恢复[47-48]；多能间充质干细胞外泌体miR-133b可以提高神经可塑性和功能恢复[49-50]；经LPS预处理的MSCs外泌体let-7b通过TLR4/NF-κB/STAT3/AKT信号通路调节炎症反应并激活M1型巨噬细胞[51],促进神经损伤部位血管生成,从而加速“神经桥”的建立。

图2 外泌体miRNA在PNI修复中的作用

4 展望

尽管显微外科及神经移植等修复PNI的方法可以恢复周围神经的连续性，但神经功能的恢复效果仍然不尽如意，PNI的治疗依旧是临床的棘手问题。PNI修复再生是一个多因素多通路调控的过程，miRNA及外泌体包含的miRNA在这个过程中发挥着复杂重要的作用，更加深入的探讨PNI修复机制，据修复过程的关键靶点研发新型药物以干预神经修复过程，例如使华勒变性顺利完成、促进雪旺细胞去分化为修复雪旺细胞、促修复雪旺细胞增殖迁移、促进神经生长相关因子表达以及加速轴突再生等，是将来治疗PNI的新方向，值得继续深入研究。