中枢神经系统来源的HMGB1表达模式和释放特征

孙燕，万忠均，毛亮，吴轶凡，杨娅楠，阿如娜

(中南民族大学 生命科学学院，武汉神经科学与神经工程研究所，武汉 430074)

中枢神经系统(CNS)是一种封闭的微环境，其血脑屏障限制了免疫细胞和相关分子进入CNS，生理状态下定居CNS的胶质细胞能维持微环境的稳态[1].其中，星形胶质细胞(astrocyte)具有复杂多样的结构和功能，参与神经系统发育、组织修复与再生等功能，并对多种神经疾病病理机制发挥着重要作用[2].小胶质细胞(microglia)是CNS 定居的巨噬细胞，具有抗原呈递、吞噬功能和分泌细胞因子等功能[3].神经元细胞(neuron)具有长突起，由胞体与细胞突起构成，组成神经系统功能和结构的基本单位.

高迁移率族蛋白 1(HMGB1)是一种非组蛋白染色体结合核蛋白[4]，几乎表达在所有真核细胞内，维持细胞核环境稳态，影响核染色质功能和基因调控[5]. HMGB1的不同生理功能主要依赖于它在细胞内的定位和分布.当细胞损伤时或在某些促炎症性细胞因子作用下，HMGB1从核内向胞浆转位或释放到细胞外调节机体免疫应答和炎症反应[6]；生理和应激状态下，星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元HMGB1表达模式和释放特征尚未完全阐明.在机体遗传发育过程中 CNS 定居的神经细胞表达HMGB1，展现出复杂的表达量、细胞定位和亚细胞定位的变化，提示HMGB1可能具有CNS特异性的功能和释放特征，在CNS 组织特异性疾病中发挥重要作用.

本文利用免疫印迹和细胞免疫荧光双标记方法，观察U87, BV2和N2a和原代星形胶质细胞和神经元HMGB1表达模式的改变以及不同应激状态下U87,BV2和N2a的HMGB1释放特征.结果发现：生理状态下，星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元细胞核表达HMGB1；应激状态下，PTX和/或ATP刺激细胞后其HMGB1释放特征不同，其中U87和BV2主动分泌HMGB1，N2a细胞被动释放HMGB1.

1 实验材料

1.1 动物和细胞株

8～10周雄性和雌性C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，饲养于温度湿度可控的中南民族大学实验动物中心SPF级动物房，遵照《中南民族大学实验动物使用与福利指导手册》；小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2a(N2a)、小鼠小胶质细胞(BV2)、人脑胶质瘤细胞(U87)由本室保存.

1.2 实验试剂

DMEM和DMEM/F12培养基、新生牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶、Neurobasal-A培养基、B27、L-谷氨酰胺、PFA和DAPI(GIBCO)；RIPA单去污剂裂解液、5×蛋白上样缓冲液、牛血清白蛋白BSA、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、山羊抗兔IgG(H+L)、SDS-PAGE试剂盒、PVDF膜(碧云天)，抽提胞浆蛋白-核蛋白试剂盒(美国Viagene)；SM0671预染蛋白Marker、BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific)；ECL化学发光试剂盒(Biosharp)；细胞免疫荧光染色一抗和荧光二抗(见表1).

表1 细胞免疫荧光染色一抗和二抗Tab.1 Primary antibody and second antibody of cell immunofluorescent staining

1.3 实验仪器

-80 ℃冰箱(中科美菱)；Western Blot模具及电泳槽(LAB-EYE MP-4，上海创萌)；稳压稳流电泳仪(DYY-8型，北京六一)；化学发光成像系统(ChemiScope 3300 mini，上海勤翔科学仪器)；超净化工作台(SW-CJ-1FD型，苏州净化)；CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific)；激光共聚焦显微镜(FV-500，日本Olympus).

2 实验方法

2.1 细胞培养

将N2a、BV2和 U87细胞常规培养于含10%新生牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，每3 d全量换液，每4 d以0.25%胰蛋白酶消化和传化.免疫荧光检测所需的爬片细胞均处于对数生长期，且细胞生长至90%融合状态.

2.2 大脑皮层原代星形胶质细胞和神经元培养

分离新生C57BL/6小鼠的大脑皮层，将皮层剪碎成约1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，0.25%胰蛋白酶消化 15 min，加入等体积含10% FBS的 DMEM/F12完全培养基终止消化，4 ℃ 800 r/min离心8 min后弃上清液，DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀并过滤.星形胶质细胞以1×107个/mL细胞接种于25 cm2培养皿中，置于 37 ℃、5% CO2培养箱培养40 min，内皮细胞贴壁生长后，取上清接种于新的培养瓶，继续培养.24 h后全量更换含10% FBS的 DMEM/F12完全培养基，每4 d更换完全培养基.培养18 d进行原代星形胶质细胞的分离、纯化、传代和鉴定，得到98%以上纯化的星形胶质细胞.

大脑皮层原代神经元以2×105个/mL细胞密度接种6孔板培养，4 h后将DMEM/F12培养基全量更换成含2% B27和1% L-谷氨酰胺的 Neurobasal-A培养基，维持培养24 h后全量更换培养基，每隔 3 d 半量更换维持培养基.大脑皮层原代神经元培养7 d，进行后续Western Blot或细胞免疫荧光检测.

2.3 LPS, PTX, PTX/ATP刺激细胞

将细胞按1×106个/孔接种6孔板，每孔加入1 mL含10% FBS的DMEM/F12完全培养基，分别用500 ng/mL LPS、200 ng/mL PTX处理细胞，24 h后收集刺激后的培养上清和细胞. PTX实验组：使用200 ng/mL PTX分别处理U87, BV2和N2a细胞，PTX刺激24 h后收集刺激后的培养上清，为单独PTX实验组. PTX刺激24 h后换用6 mM ATP继续刺激培养45 min(各孔再加入1 mL含有ATP新鲜的含10% FBS的DMEM完全培养基)，再收集ATP刺激后的培养上清，为PTX/ATP实验组.

2.4 收集细胞培养上清和检测细胞成活率

采用50 mL和3 kDa 超滤管收集细胞培养上清，4 ℃ 4500 r/min离心45 min将上清浓缩6倍后，Western Blot检测浓缩上清中HMGB1蛋白表达.并用0.25%胰蛋白酶消化U87, BV2和N2a细胞，预冷PBS洗涤、重悬，取100 μL用于台盼蓝拒染法分别检测U87, BV2和N2a生存率.

2.5 Western Blot检测HMGB1蛋白表达

采用Western Blot分别检测贴壁细胞中HMGB1总蛋白、胞浆蛋白和核蛋白的表达：将培养瓶置于冰盒上操作，PBS 漂洗贴壁细胞 3 次，加入100 μL含蛋白酶抑制剂(100 μg/mL PMSF和1 μg/mL aprotimin)的RIPA摇匀，冰上放至30 min，4 ℃ 12000 r/min离心10 min，收集上清进行SDS-PAGE检测目的蛋白HMGB1表达.胞浆蛋白-核蛋白的抽提操作流程参见贴壁细胞的胞浆蛋白-核蛋白试剂盒说明书.取3 μL蛋白样本用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，所有样品上样量均为40 μg蛋白质.

SDS-PAGE电泳条件：积层胶80 mV，分离胶120 mV，电泳2.5 h；蛋白质电转移，选择恒流200 mA，湿转法转移至PVDF膜1 h.用5%脱脂奶粉4 ℃封闭PVDF膜过夜, TBST漂洗膜4次，每次10 min; 加入5%脱脂牛奶稀释的一抗(浓度分别为1∶8000 HMGB1、1∶1000 β-actin、1∶4000 Lamin B1)，室温孵育3 h. TBST漂洗膜4次，每次10 min, 分别加入1∶4000 5%脱脂牛奶稀释HRP标记的二抗，室温摇床孵育膜1 h; TBST漂洗膜6次，每次10 min; ECL化学发光试剂盒显色反应，化学发光成像系统拍照.

2.6 细胞免疫荧光双标记检测

以1×103个/mL细胞密度接种至12 孔培养板内0.5 cm×0.5 cm 盖玻片，待细胞生长至90%融合状态.TBS 漂洗盖玻片3次，每次5 min.4% PFA 固定细胞 15 min. TBS 漂洗盖玻片3次，每次5 min.5% BSA室温封闭2 h，分别加入不同来源的一抗，室温孵育 2 h后置于 4 ℃孵育过夜.TBS 漂洗盖玻片3次，每次5 min.加入荧光标记的二抗，37 ℃避光孵育 1 h. TBS 漂洗盖玻片3次，每次5 min.加入 1∶10000 TBS 稀释的DAPI染细胞核 5 min. TBS 漂洗盖玻片3次，每次5 min.抗荧光淬灭封片剂封片，激光扫描共聚焦显微镜拍照记录.

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 U87细胞核表达HMGB1

传代培养人脑胶质瘤细胞(U87)，镜下观察培养7 d的U87细胞，显示胞体贴壁生长，生长密度大，呈梭形或三角形(见图1a).提取 U87细胞总蛋白、胞浆蛋白及核蛋白进行Western Blot检测，显示U87细胞核表达HMGB1蛋白(见图1b).用免疫荧光双重染色对U87细胞的HMGB1和星形胶质细胞特异性标记物(GFAP+)进行标记，细胞核(DAPI+)复染，进一步证实HMGB1与GFAP双阳性细胞有共定位，且HMGB1定位于细胞核(见图1c).以上结果表明：生理条件U87细胞核表达HMGB1.

图1 U87细胞核表达HMGB1Fig.1 Nuclear location of HMGB1 in U87

3.2 BV2细胞核表达HMGB1

传代培养小鼠小胶质细胞(BV2)，镜下观察培养7 d后BV2细胞的生长状态，显示BV2细胞胞体贴壁生长，生长密度大，呈圆形或椭圆形(见图2a).提取BV2细胞总蛋白、胞浆蛋白及核蛋白进行Western Blot检测，显示BV2细胞核表达HMGB1蛋白(见图2b).用免疫荧光双重染色对BV2细胞的HMGB1和小胶质细胞特异性标记物(CD68+)进行标记，细胞核(DAPI+)复染，显示HMGB1与CD68双阳性细胞有共定位，且HMGB1定位于细胞核(见图2c).以上结果表明：生理条件下BV2细胞核表达HMGB1.

图2 BV2细胞核表达HMGB1Fig.2 Nuclear location of HMGB1 in BV2

3.3 N2a细胞核表达HMGB1

传代培养小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)，镜下观察培养7 d后的N2a细胞，显示胞体贴壁生长，生长密度大，呈圆形或梯形，具有轴突样结构(见图3a).提取N2a细胞总蛋白、胞浆蛋白及核蛋白进行Western Blot检测，显示N2a细胞核表达HMGB1(见图3b).对N2a细胞中HMGB1与神经元特异性标记物(NeuN+)进行免疫荧光双重染色，细胞核(DAPI+)复染，显示HMGB1与NeuN双阳性细胞有共定位，且HMGB1定位于细胞核(见图3c).以上结果表明：生理条件下N2a细胞核表达HMGB1.

图3 N2a细胞核表达HMGB1Fig.3 Nuclear location of HMGB1 in N2a

3.4 小鼠大脑皮层原代星形胶质细胞细胞核表达HMGB1

原代培养新生 C57BL/6小 鼠的大脑皮层星形胶质细胞，对培养18 d的星形胶质细胞进行分离、纯化和传代，第4代原代贴壁生长，呈细长型，边缘清晰，立体感强(见图4a).

图4 小鼠大脑皮层原代星形胶质细胞细胞核表达HMGB1Fig.4 Nuclear location of HMGB1 in mouse cerebral cortexprimary astrocytes

同时，提取星形胶质细胞的总蛋白、胞浆蛋白及核蛋白进行Western Blot检测，显示原代星形胶质的细胞核表达HMGB1(见图4b).此外，对星形胶质细胞的纯度进行鉴定，星形胶质细胞特异性标记物(GFAP)与细胞核DAPI进行免疫荧光双重染色，显示星形胶质细胞的纯度达到98%以上(见图4c).以上结果表明：生理条件下小鼠大脑皮层原代星形胶质的细胞核表达HMGB1.

3.5 小鼠大脑皮层原代神经元细胞核表达HMGB1

原代培养新生 C57BL/6小 鼠的大脑皮层神经元，镜下分别观察培养第3, 5, 7 d神经元的生长和形态变化，结果显示：第3 d从神经元胞体的伸出突起逐渐增多并延长，大多以锥体细胞为主；第5 d神经元开始成熟，胞体晕光明显，胞质和核清晰可见，有立体感，折光性强；第7 d神经元胞体逐渐增大，突起增粗，边缘清晰，立体感强，相邻突起相互交织成网，形成更加稠密的神经网络(见图5a).神经元特异性标记物(NeuN+)进行免疫荧光染色，细胞核(DAPI+)复染.取第7 d原代培养，神经元纯度达到99%以上(见图5b). 同时，提取第7 d神经元的总蛋白、胞浆蛋白及核蛋白进行Western Blot检测，显示神经元的细胞核表达HMGB1(见图5c).以上表明：生理条件下小鼠大脑皮层原代神经元细胞核表达HMGB1.

图5 小鼠大脑皮层原代神经元细胞核表达HMGB1Fig.5 Nuclear location of HMGB1 in mouse cerebral cortex primary neurons

3.6 U87、BV2和N2a细胞HMGB1释放特征不同

LPS, PTX, PTX/ATP分别处理U87,V2和N2a细胞，3 KDa超滤管将刺激后的培养上清浓缩6倍，Western Blot检测浓缩上清中HMGB1蛋白表达，台盼蓝拒染法检测细胞生存率(见图6a和6b).与对照组Medium比较，PTX和PTX/ATP处理组的U87和BV2细胞上清中均显示HMGB1蛋白表达，但细胞存活率无统计学差异.用台盼蓝拒染法计数活细胞，阳性对照24 h-LPS刺激不会导致 BV2细胞死亡，存活率达到100%.

相反，单独PTX和PTX/ATP处理组的N2a细胞上清中也显示HMGB1蛋白表达，但细胞存活率明显下降(见图6c). 与Medium组相比较，单独PTX处理组和PTX/ATP处理组均具有显著性统计学差异(P<0.01)；与PTX处理组相比较，PTX/ATP处理组细胞存活率明显下降，具有显著性统计学差异(P<0.05).以上结果表明：单独PTX, PTX/ATP刺激细胞后其HMGB1释放特征不同，其中U87和BV2主动分泌HMGB1，N2a细胞被动释放HMGB1.

与Medium组相比，**P<0.01；与PTX组相比，#P<0.05图6 体外BV2, U87和N2a 细胞HMGB1释放特征Fig.6 In vitro release characteristics of HMGB1 from U87, BV2 and N2a

4 讨论

作为一种核因子，警报素HMGB1在细胞坏死或受损时从细胞核释放到胞外，因此，病理生理状态下HMGB1的功能和释放特征备受关注.胞外HMGB1主要通过结合晚期糖基化终末产物受体(RAGE)或Toll样受体(TLR)如TLR2和TLR4分泌大量的促炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6以及趋化因子和粘附分子，参与神经系统疾病如脑卒中[7].此时，胞外HMGB1有助于机体无菌炎症反应.

大脑发育的不同阶段HMGB1呈现出复杂的时间、空间表达模式变化，在E14.5胚胎期大脑皮层中HMGB1主要定位于细胞核，但约有1%细胞的胞质表达HMGB1；在E16胚胎期，分散表达在细胞核内的HMGB1从脑室下区向大脑皮层迁移;随着胚胎期大脑发育HMGB1表达逐渐下降，而成年小鼠HMGB1在具有神经再生能力的区域表达升高[8]，提示了HMGB1在CNS发挥着独特作用. CNS定居细胞主要有星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元，HMGB1不同的病理生理功能主要依赖于它在细胞内的定位和分布.本文研究发现：生理条件下，CNS来源的星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元的胞核均表达HMGB1；单独PTX, PTX及ATP能诱导U87和BV2主动分泌HMGB1，N2a细胞被动释放HMGB1. 其应激状态是否促进HMGB1翻译后修饰(乙酰化、甲基化、磷酸化和聚核糖基化)来协助HMGB1出核释放胞外仍有待进一步研究.本文为后续利用中国人脑库中心(CBBC)资源[9]进一步研究HMGB1在神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)的作用机制奠定了基础.