球等鞭金藻Cryl-like基因克隆及生物信息学分析

龚林，赵靖悦，雷娜娜，胡荣飞，陈由强，薛婷，何文锦

（1.福建师范大学生命科学学院海洋生物医药与制品产业化开发技术公共服务平台，福建 福州 350117；2.福建师范大学南方海洋研究院福建省微藻种质改良工程技术研究中心，福建 福州 350117）

植物在生长发育过程中，会受到各种环境条件的影响，其中光的影响至关重要。光对植物的作用有两方面：一方面是给植物进行光合作用提供必不可少的能量，另一方面可以调节植物的生长发育，即光形态建成或光控发育[1]。在植物光形态建成过程中感受光信号的物质是光受体，相关研究发现植物主要有2种光受体：一是红光受体，即光敏色素(phytochrome)，接受红光或远红光；二是蓝光受体，接受蓝光或紫光，而蓝光受体包含隐花色素(cryptochrome)和向光素(phototropin)两种[2]。

隐花色素存在于细菌、植物、动物和人体内，分为3类：动物隐花色素、植物隐花色素和DASH隐花色素。有研究表明，除了DASH隐花色素具有修复单链DNA的功能[3]之外，其它隐花色素都没有DNA修复功能。在Cry1和Cry2的C端包含一个可变区域，即功能区域；N端有2种分子，一个是甲基四氢叶酸MTHF，另一个是FAD[4]。Cry1和Cry2主要定位于细胞核内，是一类吸收蓝光(400～500 nm)和近紫外光(320～400 nm)的光受体，在蓝紫光区有3个吸收峰(通常在450、420、480 nm左右)，在近紫外光区有1个吸收峰(通常在370～380 nm），不同植物对蓝光效应的作用光谱稍有差异。经过长期研究，现己知隐花色素在植物种子萌发中起去黄化作用，光周期诱导开花和起调节昼夜节律作用[5]。

蓝光对藻类生长发育及代谢物生成积累影响机制的相关研究不断深入。有研究表明，蓝光可调控莱茵衣藻的细胞周期循环、节律、叶绿素及类胡萝卜素合成等相关生理过程[6]；蓝光可以有效诱导雨生红球藻虾青素的合成与积累，对雨生红球藻虾青合成积累具有重要影响[7]。隐花色素结构与功能在微藻中研究日渐深入，目前在模式微藻三角褐指藻、莱茵衣藻和金驼球藻中均有相关研究和报道[8～10]。球等鞭金藻近缘物种海洋球石藻等物种隐花色素基因在NCBI数据库上已有发表，但是球等鞭金藻隐花色素基因功能与结构等方面研究尚未见报道，其基因组数据库也尚未发表。

本研究以球等鞭金藻为材料，在实验室建立的球等鞭金藻基因组数据库中查找出一条隐花色素基因——Cryl-like，通过PCR获取该基因DNA全长、重叠延伸PCR获取其cDNA全长。对Cryl-like基因进行蛋白质理化性质、二三级结构等相关生物信息学分析，为后续探讨球等鞭金藻中隐花色素响应蓝光机制提供理论依据，为隐花色素参与球等鞭金藻光响应机制等方面的功能研究奠定理论基础。

1 实验材料与方法

1.1 材料

球等鞭金藻 (Isochrysis galbana)藻种来源于上海光语生物科技有限公司。培养周期为光∶暗=12h∶12h，光照强度3500 lux，温度18 ℃，培养于锥形瓶中。培养基采用f/2 培养基[11]。

HiFi Taq DNA聚合酶、Trizol试剂、反转录试剂盒均购自TransGen；pMD 19-T载体购自Takara；胶回收试剂盒购自Tiangen；氨苄青霉素(Amp)购自上海生物工程公司；其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 基因序列获取

利用NCBI数据库上拟南芥隐花色素基因蛋白序列，与本实验室建立的球等鞭金藻基因组数据库中比对找出同源序列Cryl-like基因蛋白序列。再从球等鞭金藻基因组和转录组数据库分别查找出Cryl-like基因DNA和cDNA序列，其中DNA序列全长2913 bp，cDNA序列全长2316 bp。

1.2.2 基因组DNA、RNA的提取

取培养2周处于对数生长期的球等鞭金藻藻液，参照微藻CTAB法[11]提取基因组总DNA。总RNA的提取参照Trizol说明书。琼脂糖凝胶电泳检测DNA、RNA质量，紫外分光光度计测定浓度。

1.2.3 PCR反应

利用引物设计软件primer5设计球等鞭金藻Cryl-like基因DNA、cDNA全长序列特异性引物，引物由上海生工生物公司合成。5'端引物（F）：5'-ATGCGTGTCGAGCTTTTCGTG-3'；3'端引物（R):5'-TCAGCGCATATACTTCTTTATGCTG-3'。

PCR反应体系为50 uL(含10×buffer 5 uL，dNTP Mixture[each 2.5 mmol/L]4ul，GC enhancer 5 ul，上下游引物各2 ul，DNA或cDNA模板1 uL， HiFi Taq酶0.4 uL，加适量灭菌超纯水到50 ul)。PCR扩增热循环为：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环。PCR产物取2 ul，使用1%琼脂糖凝胶电泳分析并纯化回收。

1.2.4 目的基因片段的克隆及测序

采用Tiangen胶回收试剂盒进行PCR产物回收，随后将回收产物与pMD-19t载体进行16 ℃过夜连接，连接酶选用Ligation Solution I。次日将连接产物转化进E.coli DH5α感受态细胞，涂于带有氨苄青霉素抗性琼脂平板。通过菌液PCR筛选出阳性克隆，阳性克隆摇菌过夜再提取质粒送测序公司测序。

1.2.5 序列生物信息学分析主要运用的生信分析软件和网站

蛋白质理论等电点和分子量的计算使用ExPASy的ProtParam 程序（https://web.expasy.org/protparam/）；

蛋白质信号肽预测采用SignalP 4.0在线网站（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）；

蛋白质磷酸化位点预测采用NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；

蛋白质亚细胞定位预测采用Cell-PLoc 2.0 的Euk-mPLoc 2.0在线程序分析(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)；

蛋白质功能预测采用ExPASy主页上的Interpro在线程序（https://www.ebi.ac.uk/interpro/beta/）

蛋白质二、三级结构预测分别采用ExPASy的SOPMA程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISSMODEL程序（https://swissmodel.expasy.org/）；

蛋白质保守结构域预测使用NCBI的CDD数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)；

同源序列查找使用NCBI的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；

蛋白质同源序列比对采用Clustalx软件，比对结果优化使用DANman软件；

MEGA7 软件以最大似然法（Maximum likelihood）构建进化树，分支置信度经1000次自举重复测验。

2 结果与分析

2.1 以球等鞭金藻基因组DNA为模板的PCR扩增结果

以球等鞭金藻基因组DNA为模板对进行PCR扩增，经电泳检测，与 5000 bp Ladder Marker进行比较，可见扩增片段约为3000 bp，与Cryl-like基因组DNA序列大小吻合，见图1。

2.2 PMD19-T克隆后检测结果

PMD19-T载体大小为2692 bp，与片段大小为2916 bp的 PCR扩增产物连接后重组质粒大小约为5700 bp。PMD19-T与Cryl-like基因重组质粒（下文称PMD-Cry1-like质粒）凝胶电泳图显示重组质粒片段大小与预期一致（图2）， 基因成功连接至PMD19-T质粒上。将PMD-Cry1-like质粒送测序，测序结果与球等鞭金藻Cryl-likeDNA全长序列比对，两者序列一致，通过PCR方式顺利克隆得到CryllikeDNA全长。

2.3 重叠延伸PCR获取Cryl-like基因cDNA全长

表1 重叠延伸PCR各分段引物

以球等鞭金藻cDNA为模板对 C ry1-like 基因cDNA全长进行多次PCR无果，随后采用重叠延伸PCR。利用NCBI网站上的splign程序在线对比DNA和cDNA全长序列，找出Cryl-like基因内含子和外显子各分段序列，见图3。依据图3显示的Cryl-like各分段序列，设计5'-3'端特异性引物，各分段引物如表1所示。

PCR反应条件同1.2.3，模板为PMD-Cry1-like质粒。将Cryl-like外显子分段1、2、3分别进行PCR扩增，凝胶电泳，结果显示各分段PCR产物条带大小合适（图4）。将分段1、分段2 PCR回收产物为模板进行重叠延伸PCR获得分段1+2片段，再以分段1+2和分段3的回收产物为模板用全长引物进行PCR，从而获得Cryl-like基因cDNA全长。连接Cryl-like基因cDNA序列一致，说明成功克隆得到球等鞭金藻Cryl-like基因cDNA全长。

2.4 球等鞭金藻Cryl-like基因生物信息学分析

2.4.1 球等鞭金藻Cry1-like蛋白质理化性质与功能预测

使用Protparam在线程序分析Cry1-like蛋白质等电点为8.95，分子式推测为C3791H5996N1090O1102S30，蛋白质分子量为85437.75 Da。不稳定指数为46.29，推测该蛋白为不稳定蛋白。预测在酵母中表达的半衰期大于20 h，在大肠杆菌中表达的半衰期大于l0 h，而在哺乳动物网状细胞中体外培养表达的半衰期为30 h。该蛋白由20种基本氨基酸组成，含量较高的氨基酸残基是丙氨酸（Ala，11.8%）和亮氨酸（Leu，11.0%），含量较低的氨基酸残基是半胱氨酸（Cys，1.6%）和组氨酸（His，1.9%）。其带正电荷氨基酸有89个(Asp+Glu)，带负电荷的氨基酸有100个(Arg + Lys)。经过protscale程序在线分析，氨基酸序列疏水性/亲水性预测结果表明，平均疏水性系数为-0.269，小于0，推测其为亲水性蛋白，其脂肪系数为84.37。TMHMM在线程序预测Cry1-like无跨膜结构。SignalP 4.0预测Cry1-like蛋白不存在信号肽结构。NetPhos预测Cry1-like蛋白可能存在磷酸化位点有72个，如图6所示，其中丝氨酸（Serine）有47个，苏氨酸有（Threonine）18个，络氨酸（Threshold）有7个。Euk-mPLoc 2.0预测Cry1-like蛋白定位于细胞核。利用Interproscan对其蛋白质进行功能预测，结果显示球等鞭金藻Cry1-like归属于Cryptochrome/DNA photolyase class1家族。

2.4.2 二、三级结构预测

运用ExPASy网站上SOPMA在线程序预测球等鞭金藻 Cry1-like基因二级结构，结果显示该基因主要存在α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲等二级结构。α-螺旋占比例最高的为约为43.06%，无规则卷曲约为37.35%，延伸链约为11.93%，而β-转角所占比例最少仅为7.65%。采用SWISS-MODEL在线软件进行三级结构预测，如图7所示，Cry1-like基因编码的蛋白三级结构与二级结构预测结构相符，N端区域主要有含有α-螺旋、β-转角组成，C端区域主要由无规则卷曲组成。

2.4.3 球等鞭金藻Cry1-like基因保守域分析

通过PCR得到Cry1-like基因全长cDNA后，将序列提交至NCBI网站CDD数据库对该基因的保守域进行比对分析，发现该基因存在多个隐花色素家族基因结构的保守域，如8-羧基-7,8二脱甲基-5-脱氮核黄素（8HDF）、甲基四氢叶酸(MTHF)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等[12]，并且Cry1-like基因含有上述三个保守域结构均较为完整（图8）。由此可以初步证实，球等鞭金藻Cry1-like基因属于隐花色素家族基因成员。

2.4.4 氨基酸序列同源性比对及序列进化分析

采用NCBI中的BlastP在线程序查找 Cry1-like的同源氨基酸序列，发现球等鞭金藻Cry1-like氨基酸序列与多个微藻隐花色素相关氨基酸序列同源性较高，其中有海洋球石藻（Emiliania huxleyi CCMP1516）EhCRY1（XP_005777116.1）、金藻属Chrysochromulina sp.CCMP291 hypothetical protein Ctob_011767（KOO26762.1）、蓝隐藻（Guillardia theta CCMP2712） hypothetical protein GUITHDRAFT_137315 （XP_005834512.1）、绿藻属Raphidocelis subcapitata hypothetical protein Rsub_10233(GBF97878.1) 、圆柱拟脆杆藻（Fragilariopsis cylindrus CCMP1102）FcCPD2（OEU23746.1），这五条氨基酸序列与Cry1-like氨基酸序列同源性分别为61.83%、58.90%、56.15%、53.11%、43.87%。此外， 球等鞭金藻Cry1-like与近缘物种海洋球石藻CRY1的氨基酸序列相似性高达95%。采用Clustalx软件进行序列同源性比对分析，比对结果经DNAman软件优化处理。结果显示，球等鞭金藻Cry1-like氨基酸序列与上述几个微藻隐花色素基因的氨基酸序列明显存在多处保守区域。

2.4.5 系统进化树分析

从NCBI上数据库中下载模式植物拟南芥、模式微藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum CCAP）、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和金驼球藻（Ostreococcus tauri），以及海洋球石藻等物种隐花色素基因氨基酸序列，与球等鞭金藻Cryl-like基因氨基酸序列进行序列比对后采用最大似然法（Maximum likelihood）法构建进化树（图10）。从进化树上看，Cryl-like基因与海洋球石藻Cry1，金驼球藻CPD1，小球藻CPD1，拟南芥Cry1和Cry2处于同一分支上，序列之间亲缘关系最为接近，进一步证实Cryl-like基因是球等鞭金藻的Cry1基因。

3 小结与讨论

本研究从课题组最新构建好的球等鞭金藻基因组和转录组数据库中查找出Cryl-like基因，通过分子生物学方法克隆出球等鞭金藻隐花色素Cryl-like基因DNA和cDNA全长，并对其采用了理化性质分析、磷酸化位点预测、二三级结构预测、同源序列比对、系统进化树的构建等多种生物信息学手段进行分析。通过分析，得知该基因DNA全长2916 bp、cDNA全长为2613 bp，编码771个氨基酸，预测蛋白质的等电点为8.95，预测的蛋白质分子量为85437.75 Da，且为不稳定蛋白。根据保守结构域分析发现蛋白结构域含有隐花色素基因家族都有的2个结构域：DNA光裂解酶结构域、FAD结合的结构域，初步证实Cryl-like基因属于球等鞭金藻隐花色素基因家族成员。氨基酸序列同源性比对及序列进化分析，Cryl-like基因与近缘物种海洋球石藻中的Cry1基因最为相似，并且球等鞭金藻与海洋球石藻都属于金藻成员，因此预测Cryl-like基因是球等鞭金藻中的Cry1基因。

近年来，光信号引发的微藻光响应机制成为微藻光生物学研究领域热点。真核微藻中蓝光受体基因克隆、蛋白结构、分子进化、光化学特性、生理功能及光信号转导等方面研究不断开展，取得了许多新的突破性进展[13，14]。目前研究发现动物隐花色素、植物隐花色素和DASH隐花色素三类隐花色素在绿藻、红藻、硅藻等微藻中均广泛存在。球等鞭金藻作为常见的海洋微藻，富含EPA、DHA和类胡萝卜素等营养物质[15]，这些代谢物质生成积累与球等鞭金藻光响应机制发挥作用密不可分，而隐花色素在其过程中能起何作用和其中的机制原理都值得深入研究。本实验克隆得到球等鞭金藻Cryl-like基因，为后续隐花色素基因家族结构与功能及其对蓝光光响应机制研究提供了依据。