MAST D73C 组合纸片法检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶

田东兴， 张 泓

碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）已引起了全球广泛关注。产碳青霉烯酶（KPC酶、MβL酶、OXA-48酶等）是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的主要机制[1]，其可以通过质粒、整合子等可移动元件传播引起CRE菌株的暴发流行[2]。产不同碳青霉烯酶的CRE菌株导致的感染用药方案往往不同，如头孢他啶-阿维巴坦可有效抑制产A类（如KPC、ESBL）、C类（如AmpC）、D类（如OXA-48）β内酰胺酶等酶的细菌生长，但对产B类金属酶（如NDM、IMP）则无效[3]。因此迫切需要临床微生物实验室能够快速、准确地明确碳青霉烯酶型别，帮助临床及时选择有效的抗菌药物，控制CRE进一步播散。本研究旨在分析儿童患者分离CRE中碳青霉烯酶类型分布情况，并为临床提供一种简易的碳青霉烯酶型检测方法。

1 材料与方法

1.1 一般材料

收集2016年7月-2017年12月上海市儿童医院临床分离的240株非重复CRE菌株，包括肺炎克雷伯菌185株，大肠埃希菌31株，阴沟肠杆菌19株，产气克雷伯菌5株。CRE定义为至少对一种碳青霉烯类药物（亚胺培南、美罗培南或厄他培南）耐药的肠杆菌科细菌[4]。所有菌株均采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）鉴定，质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922，购自卫生部临床检验中心。

1.2 仪器与试剂

MALDI-TOF MS（德国Bruker公司），PCR扩增仪（德国Eppendorf公司），电泳仪、Gel Doc 2000紫外线投射凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。Taq酶、dNTPs、10×缓冲液（大连TaKaRa公司），琼脂糖（西班牙Biowest公司），DL 2000 Marker、50×TAE缓冲液、Genegreen核酸染料（北京天根公司），MAST D73C组合纸片（英国MAST公司），哥伦比亚血平板、MH平板（法国梅里埃公司），抗菌药物粉剂（大连美仑生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 碳青霉烯酶基因检测 采用煮沸法提取细菌DNA作为PCR模板[5]，扩增碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaOXA-48-like、blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaAIM、blaGIM、blaBIC、blaSIM），引物序列参考文献 [6]，由上海生工有限公司合成。反应体系共25 μL，包括DNA模板1 μL、20 μmol/L上下游引物各0.5 μL、10×缓冲液2.5 μL、dNTPs 2 μL、ddH2O 18.375 μL。扩增产物用含Genegreen核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外投射凝胶成像系统拍照成像。阳性扩增产物送至上海赛音生物技术有限公司测序，测序结果提交至blast网站进行比对（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.3.2 碳青霉烯酶 MAST D73C纸片法检测组合纸片包括法罗培南（A组）、法罗培南+MβL抑制剂（B组）、法罗培南+KPC抑制剂（C组）、法罗培南+AmpC抑制剂（D组）、替莫西林+MβL抑制剂（E组）。按照CLSI M02文件中常规纸片扩散法的操作要求将上述5张纸片放入涂布有受试菌的MH平板并轻压，35 ℃孵育18～24 h后测量抑菌圈直径[7]。阳性质控菌株为本实验室经PCR确认携带blaNDM、blaOXA-232、blaKPC基因的细菌，阴性质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。结果判读规则见表 1。

表1 MAST D73C 组合纸片法结果判读规则Table 1 Interpretive criteria of MASTDISCS® combi Carba plus discs system D73C for discriminating carbapenemase phenotypes

1.3.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行分析。以PCR结果为金标准，计算组合纸片法检测碳青霉烯酶的灵敏度和特异度，并与PCR结果进行一致性分析：Kappa值＜0.4，说明一致性程度较差；Kappa 值在0.4～0.75，说明一致性程度尚可；Kappa 值＞0.75，说明一致性程度较好。Youden指数范围0～1，越接近于1，说明真实性越 好。

2 结果

2.1 碳青霉烯酶基因PCR检测

240株CRE经PCR基因检测有233株检测到碳青霉烯酶基因，以blaNDM（96株，40.00%）为主，其次是blaOXA-232（69株，28.75%）、blaKPC-2（56株，23.33%）和blaIMP（10株，4.17%），另有2株同时携带2种碳青霉烯酶基因，7株CRE未检出碳青霉烯酶基因。各菌种碳青霉烯酶基因检出情况见表 2。

表2 240 株碳青霉烯酶基因型分布Table 2 The distribution of carbapenem-resistant genes in 240 Enterobacteriaceae strains[n（%）]

2.2 组合纸片法检测碳青霉烯酶

231株单碳青霉烯酶基因表达阳性的菌株，采用MAST D73C检测有112株MβL酶阳性，63株OXA-48酶阳性，20株KPC酶阳性，36株结果无法解释。以PCR结果为金标准，采用MAST D73C判断MβL酶和OXA-48酶的灵敏度均在80%以上，特异度均在95%以上，Youden指数和Kappa值显示，区分产MβL酶和OXA-48酶菌株的真实性和一致性较好，见表3。判断KPC酶的特异度较高（99.43%），但灵敏度较差（33.93%），真实性和一致性较差。2株产双碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌用MAST D73C仅能判断出一种型别。36株CRE采用MAST D73C组合纸片法检测，获得的结果无法解释，经PCR确认有30株CRE产KPC酶，6株CRE产OXA-48酶。

表3 MAST D73C 检测碳青霉烯酶型结果与PCR 方法比较Table 3 MASTDISCS® D73C versus PCR in identifying carbapenemases or the encoding genes

2.3 组合纸片法检测KPC型碳青霉烯酶补充标准

针对MAST D73C检测KPC型碳青霉烯酶低灵敏度的缺陷，基于本次实验数据和PCR基因检测结果，建议当结果无法解释，即B-A、C-A、D-A均＜5 mm且E＞10 mm，但对法罗培南耐药时也判断为产KPC酶[8-9]。此补充标准将检测KPC酶的灵敏度由33.93%提高至87.50%，特异度为99.43%，Youden指数和Kappa值分别为0.87、0.90，真实性和一致性较好，判断其他酶型的灵敏度和特异度不变。MAST D73C检测碳青霉烯酶与PCR结果相比，总符合率为90.91%（210/231）。

3 讨论

近年来CRE检出不断增加，成为儿童健康及生命的巨大威胁和挑战，加上其易播散，已经引起全球的广泛重视[10]。明确碳青霉烯酶类型，有助于临床及时选择合适的抗生素，阻止病原菌进一步传播。2014年产NDM-1酶的肺炎克雷伯菌曾在本院引起克隆播散[11]，本次研究发现2016-2017年CRE菌株仍以产NDM-1酶为主。NDM-1酶在儿童和成人中检出均有报道，但主要在儿童中检出，由于其广泛耐药性导致感染治疗十分困难，被称为“超级细菌”。KPC酶在成人分离株中常见，此次研究中儿童分离株也有少数检出。值得注意的是，本次研究中肺炎克雷伯菌主要检出OXA-232，它是OXA-48的一种变异体。OXA-48家族目前在欧洲地区比较多见，常引起流行播散，国内也陆续有报道[12-13]，临床上应及时监测并采取切实有效的感控措施阻止其在国内引起大的流行播散。

OXA-48酶由于低碳青霉烯类MIC值常被常规表型检测方法漏检，目前需要一种可以快速准确判断产OXA-48酶菌株的方法。适合在基层微生物室开展的碳青霉烯酶表型检测方法主要有改良Hodge试验、 Carba NP试验、改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）等[14]。改良Hodge试验和Carba NP试验对OXA-48酶检出灵敏度较低，并且无法区分碳青霉烯酶型别；mCIM试验检出碳青霉烯酶的灵敏度和特异度均大于90%，与EDTA碳青霉烯类失活法（EDTA-carbapenem inactivation method， eCIM） 联合仅可区分丝氨酸碳青霉烯酶和MβL酶，临床应用受限。采用PCR方法扩增碳青霉烯酶基因并测序分析需要2～3 d，许多基层实验室还不具备开展条件，而MAST D73C组合纸片法仅需要18～20 h，并且操作简便，通过测量5张纸片抑菌圈直径就能够判断该菌株是否产碳青霉烯酶及其类型，尤其是产OXA-48酶菌株。

日本一所大学医学院认为MAST D73C可以有效判断菌株是否产碳青霉烯酶并可以区分MβL酶、KPC酶和OXA-48酶[15]，但是本研究中多数产KPC酶菌株的C-A＜5 mm，结果无法判读，导致检测KPC酶的灵敏度较低（33.93%）。Youden指数和Kappa值显示MAST D73C纸片组合区分产MβL和OXA-48酶菌株的真实性和一致性较好，但不能很好地区分产KPC酶菌株（Youden指数0.33，Kappa值0.43），可能是检测KPC酶的低灵敏度降低了可靠性。国内产KPC-2酶的肠杆菌科细菌尤其是肺炎克雷伯菌ST11型对碳青霉烯类抗生素的MIC值较高（＞32 mg/L），而国外KPC-2流行克隆型菌株MIC值相对较低[16]，推测C组纸片含有的KPC抑制剂浓度不能有效抑制碳青霉烯类高度耐药菌株中的KPC酶作用。

M A S T D 7 3 C 检 测K P C 酶 的 灵 敏 度 低（33.93%）是其重要缺陷。采用基于实验室数据和PCR结果制定的KPC型碳青霉烯酶补充标准后，灵敏度显著提高，并且不影响其他酶型的灵敏度和特异度，为实验室后续开展此种检测方法提供参考。另外6株结果仍无法解释的CRE菌株经PCR确认产OXA-48酶，这也是造成MAST D73C组合纸片检测OXA-48类酶的灵敏度不是100%的原因之一。MAST D73C检测碳青霉烯酶与PCR结果相比，总符合率为90.91%，能够在一定程度上对碳青霉烯酶型别进行区分。2018年CLSI标准评价eCIM检测灵敏度＞95%，特异度大于92%[17]。本研究中组合纸片法筛选MβL酶的灵敏度和特异度均高于CLSI标准，可以准确检测产金属酶的菌株。此前有报道组合纸片方法可以判断同时产OXA-181和NDM-1酶菌株[13]，本研究对同时产KPC-2酶和NDM-1酶菌株仅判断为MβL酶，产KPC-2酶和IMP-4酶菌株仅判断为KPC酶，发现对产多种碳青霉烯酶菌株的判断仍存在一定局限性。此外，组合纸片法可以初步判断产AmpC酶伴膜孔蛋白缺失，本研究中未进行验证，仍需进一步研究。

目前CRE的治疗仍是临床医师面临的挑战，临床极需创新药物应对碳青霉烯类耐药性的威胁。日前国家药品监督管理局批准新型抗生素头孢他啶-阿维巴坦，用于肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌引起的感染。酶抑制剂阿维巴坦除金属酶外较已经上市的一些复合制剂中的克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等具有更加好的抑酶谱和抑酶活性，由于其为一非自杀性抑制剂，故抑酶的周期高于上述酶抑制剂[18]。因此，明确碳青霉烯酶型别不仅可以用于流行病学研究和制定感控策略，也可以更有效地指导临床用药。MAST D73C组合纸片法可在一定程度上简便快速地判断碳青霉烯酶型别，有助于临床更合理地应用抗菌药 物。