外泌体在乳腺癌诊治中的研究进展

梅兆玲， 周文辉， 冯 景

（1.安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232001；2.安徽理工大学附属奉贤医院检验科，上海 201499）

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤，居我国女性恶性肿瘤发病率的首位[1]。乳腺癌的早期诊断与治疗能够显著改善乳腺癌患者的生存质量，并延长其生存时间。乳腺癌的常规治疗方式主要为外科手术、放化疗及生物靶向治疗。虽然基于众多肿瘤标志物的新型靶向抗肿瘤药物逐渐被应用于临床，但乳腺癌的早期转移与复发仍是威胁乳腺癌患者生存的主要原因[2]。近年来，由于外泌体具有良好的生物相容性、固有循环属性、膜蛋白靶向性以及强大的物质携载属性，在肿瘤的诊疗中备受瞩目。本文就外泌体在乳腺癌诊疗中的研究进展作一概述，旨在进一步探讨外泌体作为乳腺癌早期诊断指标和治疗载体的可行性。

1 外泌体的形成及功能

外泌体是由大多数细胞分泌产生的直径为30～100 nm的脂质双层小囊泡，囊泡内含有丰富的核酸[DNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、环状RNA（circular RNA，circRNA）、信使RNA等]、蛋白质及脂质等物质[3]。外泌体广泛存在于体液（血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁等）中，其内容物的确切成分主要取决于分泌细胞[4]。通过特异性内容物的靶向递送，外泌体在改变细胞行为、介导细胞信号交流中发挥重要作用[5]。在乳腺癌中，肿瘤细胞释放的外泌体在乳腺癌细胞增殖、自我更新、干性维持、肿瘤耐药、微环境调控以及肿瘤转移和复发中发挥重要的驱动作用[6]。

2 外泌体在乳腺癌早期诊断中的作用

乳腺癌的诊断主要依赖于体格检查、影像学检查、病理检查及血清学标志物检测，但这些诊断方法受瘤体大小、病理分型及特异性的限制，而且还可能会对患者的身体产生不良影响。因此，寻找无创、敏感性与特异性更好的乳腺癌早期诊断新型生物标志物成为当前的研究热点。乳腺癌患者发病后，机体会大量合成并分泌外泌体，外泌体中包含多种具有乳腺癌细胞特异性的蛋白质、miRNA及长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等物质，并且广泛存在于患者的血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁等体液中。因此，乳腺癌外泌体可以作为乳腺癌早期诊断的有效标志物。在蛋白水平，除发挥正常生物学功能的热休克蛋白（heat shock protein，HSP）70和HSP90外，外泌体所携带的肿瘤抗原[人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）、癌胚抗原、gp100蛋白等]及死亡受体蛋白（FasL、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体等）对于乳腺癌的诊断及预后监测均具有重要的参考价值[7-11]。在核酸水平，与健康女性比较，乳腺癌患者体液来源的外泌体中，miRNA-21、miRNA-155、miRNA-1246、miRNA-101、miRNA-372的表达量明显升高，且与乳腺癌不良预后显著相关[12-13]。“三阴性”乳腺癌患者miRNA-373表达量明显高于雌激素受体阳性的Luminal型乳腺癌患者[13]。此外，还有研究结果表明，miRNA-105、miRNA-122、miRNA-141参与了乳腺癌脑转移，与乳腺癌的复发相关，因此可将外周血miRNA-105、miRNA-122、miRNA-141作为诊断乳腺癌脑转移与复发的潜在生物标志物[14]。由于外泌体中的lncRNA表达量相对较低，且检测难度大，目前相关研究较少。

外泌体miRNA作为乳腺癌重要的诊断指标已被广泛认可，但是目前检测外泌体miRNA的方法仍存在耗时、回收效率低的问题。此外，提取miRNA时还需破坏外泌体，易造成miRNA损失并影响检测结果的准确性。因此，目前亟需建立一种可以快速、准确地检测外泌体内miRNA的方法。有学者制备了一种仿病毒融合囊泡，该囊泡可以通过与外泌体膜的融合将分子信标主动递送到外泌体内部，从而实现外泌体内特异miRNA的准确、快速、原位检测；在此基础上，他们又进一步开发了一类高效、多指标检测的膜融合囊泡，通过融合蛋白和多肽的筛选，提高囊泡的融合效率；通过多种核酸分子信标的同时包载，实现多种肿瘤特异外泌体miRNA的同步检测，获得更丰富的肿瘤诊断信息[15]。

3 外泌体在乳腺癌治疗中的作用

侵袭、转移和耐药是肿瘤治疗失败的主要原因。外泌体作为细胞间核酸及蛋白质等物质传递的主要方式，在促进肿瘤细胞耐药、侵袭、转移中发挥了关键作用[16-17]。外泌体除了作为液体活检的目标待测物用于乳腺癌的诊断外，在乳腺癌治疗上也发挥着日益重要的作用，包括调控外泌体的表达、将外泌体作为药物运输载体、将外泌体进行工程化修饰用于靶向治疗等。

3.1 通过调控外泌体的表达来治疗乳腺癌

近年来，学者们发现有多种药物可通过抑制外泌体的表达来发挥抗肿瘤作用，如抗菌药物磺胺异噁唑可通过降低外泌体分泌的内皮素受体A的表达来抑制乳腺癌外泌体的产生，在乳腺癌移植瘤模型中显示出抗肿瘤和抗转移作用[18]；卤夫酮可显著降低乳腺癌细胞外泌体的释放，减少miRNA-31的传递，进而抑制乳腺癌细胞的增殖[19]；紫草素能够显著抑制乳腺癌细胞外泌体的分泌，从而改变肿瘤微环境，并抑制乳腺癌细胞进一步增殖[20]。尽管通过调控肿瘤细胞来源的外泌体用于乳腺癌治疗这一想法在很久之前就已经出现，但实际进展并不理想。

3.2 将外泌体作为药物运输载体治疗乳腺癌

常规化疗药物（紫杉醇、他莫昔芬、常春新碱等）由于具有较强的细胞毒性及较弱的组织选择能力，在用于乳腺癌治疗时常会产生严重的毒副作用。细胞来源的外泌体除具有良好的生物兼容性外，还具备强大的生物运载能力。因此，外泌体正逐步成为乳腺癌化疗药物递送的载体。目前，外泌体药物装载的主要方式有转染试剂法[21]、超声法[22]、冻融循环法[23]、电穿孔法[24]等。MILANO等[25]的研究结果显示，在大鼠模型中，间充质祖细胞来源的外泌体包载的多柔比星/曲妥珠单抗能够显著改善其心脏毒性，并增强对乳腺癌细胞的细胞毒作用。KALIMUTHU等[26]利用间充质干细胞来源的外泌体包载紫杉醇，显示出更好的体内外抗肿瘤效果。

外泌体除作为化疗药物理想的载体外，对小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）及miRNA等人工合成的核酸类物质也有非常好的传递作用。LIMONI等[27]通过特异性改造，将siRNA装载于HEK293细胞来源的外泌体中，改造后的外泌体显示出显著的HER-2靶向性，并成功敲低乳腺癌细胞TPD52基因的表达。ALVAREZ-ERVITI等[28]通过电穿孔法将siRNA装载至树突状细胞来源的外泌体中，可有效降低小鼠脑细胞中BACE1基因的表达。LIANG等[29]将抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶和miRNA-21寡核苷酸拮抗片段一同包裹在外泌体中，成功实现了HER-2阳性肿瘤细胞的靶向治疗。

3.3 通过外泌体的工程化修饰来进行乳腺癌的靶向治疗

相对于直接装载治疗药物的外泌体而言，工程化的外泌体修饰因方式多样、生物学功能众多而更加受青睐。外泌体表面定向性修饰是增强外泌体靶向性的一种有效方式。YU等[30]通过修饰改造，将化疗药物Erastin成功装载于叶酸标记的外泌体中，实现了乳腺癌的靶向治疗。XIONG等[31]通过计算机建模，设计并采用巨噬细胞制备了一种NPs/Rex外泌体，该工程化外泌体在体内显示出更长的血液循环半衰期、更强的靶向性、更好的生物相容性，对原位乳腺癌肺转移病灶具有更好的靶向化疗作用。LI等[32]通过对巨噬细胞来源的外泌体做c-Met修饰，成功实现了外泌体携带多西他滨对乳腺癌的靶向治疗。

通过制备工程化修饰的外泌体用以激活机体免疫，从而实现肿瘤的免疫治疗是外泌体工程化修饰用于肿瘤治疗的另一种有效方式。有学者利用外泌体锚定肽CP05将高迁移率族核小体结合域蛋白1（high mobility group nucleosome binding domain protein 1，HMGN1）的功能短肽N1ND负载于不同肿瘤细胞来源的外泌体表面，修饰后的外泌体在被运输到树突状细胞中后，成功活化机体免疫功能，实现了中晚期肝癌、胰腺癌和乳腺癌的免疫治疗[33-34]。SHI等[35]通过修饰改造，在外泌体的表面同时表达T细胞CD3抗体和HER-2抗体，借助2个抗体的作用将HER-2阳性的乳腺癌细胞呈递给CD3+T细胞，从而实现乳腺癌的免疫治疗。

4 小结与展望

在过去的几十年中，随着外泌体相关研究的不断深入，人们对外泌体有了更全面的认识，同时不断探索基于外泌体的乳腺癌诊疗方式。当前，制约外泌体用于肿瘤诊疗的因素主要有以下3点：（1）外泌体的提取、鉴定方式并不统一。相对于品种繁多的商品化提取试剂，传统的超速离心法更具权威性，但也是最繁琐、要求最高的分离方式；外泌体的鉴定除电子显微镜外，并不能进行有效的定量分析。因此，建立行之有效的、统一的外泌体分离及鉴定方法显得尤为紧迫。（2）外泌体的基础生物学知识仍需要进一步深入探索，如外泌体在体内分布的行为方式，只有明确了这一点，才能有效避免外泌体药物在肝脏中的富集和清除。（3）更为有效、精准的外泌体改造方式仍需进一步研究。

虽然到目前为止还没有一种基于外泌体的抗肿瘤药物获批上市，但得益于外泌体的天然属性及其强大的物质运载能力，外泌体依然有成为肿瘤靶向药物的巨大潜力。外泌体的工程化修饰用于肿瘤的靶向治疗及免疫治疗，将是未来外泌体抗肿瘤药物研发的关键所在。