悬浮培养技术在猪圆环疫苗生产中的应用

李少丽 邵攀峰 朱国坡 尹忠良

杭州佑本动物疫苗有限公司，杭州 310018

1 猪圆环病毒概况

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是目前发现的脊椎动物中最小的一种动物病毒，该病毒可分为PCV1 和PCV2 两种血清型。PCV1 对猪无致病性，广泛存在于猪体内和猪源传代细胞系中，PCV2可在猪群内引发多种传染病，如断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）等。PCV2 不仅可造成仔猪生长缓慢，而且还会侵害猪的免疫系统，导致猪群免疫抑制，影响其他疫苗的免疫效果，并引发其他病原的继发感染。PCV2 基因组大小为1 766～1 768 bp，共包括ORF1 和ORF2在内的11 个ORF。ORF2 编码病毒衣壳蛋白（Cap蛋白），Cap 蛋白为病毒的主要结构蛋白，是刺激机体产生免疫应答的主要抗原，也是基因工程亚单位疫苗研究的热点。目前，针对圆环病的商品化疫苗国内已有30 多家，主要为全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗。目前，国内疫苗企业上市的全病毒灭活疫苗均为转瓶工艺。

2 悬浮培养技术在猪用疫苗生产中的应用

随着细胞培养技术的不断发展成熟，许多细胞已从传统的转瓶培养被驯化为悬浮培养。悬浮培养技术具有病毒产量高、生产周期短、污染小、批间稳定、操作方便、可自动化控制、劳动成本低等优势，其可分为微载体悬浮培养和全悬浮培养2 种方式。微载体培养是以细小的颗粒作为细胞载体，通过搅拌使细胞悬浮在培养液内，细胞在载体表面生长成单层的一种细胞培养方式。常用的微载体一般为纸片载体或球状载体，球状载体相对于纸片载体更容易进行细胞观察。1962年，Capstick PB 首次采用BHK21 细胞悬浮培养FMDV[1]；1965年，TellingR.C使用发酵罐悬浮培养BHK21 细胞进行FMDV 的批量生产[2]。周燕等[3]利用生物反应器培养ST 细胞进行TGEV 的繁殖，培养病毒效价为1011.3TCID50/0.2 mL，比方瓶培养效价提高约100倍。冯磊等[4]在Marc145 细胞上使用微载体悬浮灌注培养方式大规模培养PRRSV，将Marc145 细胞种子以循环灌注培养方式在5 L 反应器中完成初级培养，经消化传代工艺，将种子细胞放大接种于60 L反应器中进行分批换液式的二级培养，用于PRRSV的大规模增殖，PRRSV 的增殖滴度可达到108.3TCID50/mL，成功模拟了Marc145 细胞在工业化水平上的放大培养操作工艺，具备实际应用价值。

全悬浮培养不需要载体，培养细胞的生长密度不受附着物限制，无需胰酶消化，工艺放大相对微载体更简单，自动化程度高，长期使用成本低，但前期对细胞驯化技术要求较高。目前，实现全悬浮培养的细胞有BHK21、Vero、ST、MDCK、293 细胞等。陈文庆等[5]采用全悬浮培养口蹄疫病毒和狂犬病毒，并与转瓶培养作比较，当BHK21 细胞生长至96 h细胞密度可达5.4×106/mL，成活率维持在94%左右；从细胞数量比较，650 L 反应器培养一批的细胞数量相当于500～700 个15 L 转瓶培养的细胞总量，且病毒接种12 h 后病毒效价均比转瓶高出约100.25TCID50/mL；而采用70 L 的反应器微载体培养Vero 细胞生产狂犬病毒，其毒价要比15 L 转瓶高出10 倍，生产效率和产品质量明显提高。

3 悬浮培养在猪圆环疫苗生产中的应用

目前，关于圆环全病毒培养的研究主要集中于悬浮培养的方式。邹勇[6]利用生物反应器灌注工艺微载体培养PCV2，其病毒效价可达105.0TCID50/mL。南京农业大学何锡忠[7]利用Celli Gen 生物反应器，高密度悬浮培养PK15 细胞繁殖PCV2，同时设转瓶培养作对照，悬浮培养的病毒毒价为105.0TCID50/mL，而转瓶培养的病毒毒价为105.5TCID50/mL。张许科等[8]以聚酯、明胶、多糖为微载体，每克载体加入1.4×107～2.6×107个传代细胞，使细胞与微载体充分结合，当传代细胞培养至5.0×109～8×1010cells/L 时，换用细胞维持液，按照感染复数为MOI=0.001～1.000 接种PCV2，使病毒与细胞充分接触，运用潮汐式微载体悬浮培养技术生产的PCV2 病毒毒价可达到106.0～107.0TCID50/mL，其毒价要比转瓶的104.0TCID50/mL 高出100～1 000倍。钱钟等[9]采用灌注悬浮培养技术繁殖PCV2，病毒效价可达106.5TCID50/mL。华涛等[10]利用生物反应器微载体悬浮培养PK15 细胞，优化各重要参数条件后，收获PCV2 病毒液效价可达107.25TCID50/mL。

综合比较，细胞悬浮培养技术在圆环疫苗生产中的应用优势非常明显，而且由于全病毒含有病毒全部的抗原决定簇，免疫原性更占优势。因此，预计圆环全病毒灭活疫苗将会在很长时间占据国内市场，一旦全病毒悬浮培养技术成熟，将从很大程度上提高优质圆环全病毒灭活疫苗的产能，进一步提高疫苗质量，为猪圆环病的有效防控提供坚实的保障。