子宫内膜异位症纤维化相关重要信号通路的研究进展

姚莹，武露明，何晓，张学红

(兰州大学第一临床医学院，甘肃省生殖医学与胚胎重点实验室，兰州 730000)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)的特征是子宫外子宫内膜组织的存在，是一种常见的妇科疾病，10%～15%的女性深受其害，其中35%～50%的患者伴有骨盆疼痛和/或不孕[1-2]。在所有类型子宫内膜异位症(腹膜、卵巢、深部浸润型、子宫内膜相关粘连)发展过程中，异位的子宫内膜及其周围的纤维组织都可能导致周围结构的粘连、解剖畸变、慢性疼痛及不孕等症状[3]。目前，EMs纤维化过程中存在多种细胞信号转导通路的异常，正是这些通路的启动和相互作用促进了纤维化的形成。本文主要综述与内异症纤维化相关的重要信号传导通路，如TGF-β1/Smad 信号通路、Wnt/β-catenin 信号通路、Notch 信号通路，旨在阐明子宫内膜异位症中纤维化的发生机制，为研发抗纤维化药物及丰富临床治疗策略提供新思路。

子宫内膜异位症相关纤维化的生物学过程类似于其他纤维化疾病，它的特征是在子宫内膜腺体和间质周围过多的细胞外基质(ECM)[如α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原蛋白(Col-1)、结缔组织生长因子(CTGF)和纤连蛋白(FN)]沉积，导致组织结构破坏和子宫内膜功能受损。虽然实质细胞以及间质细胞中的单核巨噬细胞、肥大细胞等也可以产生ECM，但是被激活的肌成纤维细胞是ECM的主要来源，是纤维化的关键介质细胞[4]。有研究报道，子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞转化、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和成纤维细胞-肌成纤维细胞转化(fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation，FMT)有助于子宫内膜异位症中肌成纤维细胞的存在和纤维化的发展[3，5]。

一、TGF-β1/Smad信号通路

TGF-β1及其两个受体[转化生长因子β受体I(TGFβRI)和转化生长因子β受体II(TGFβRII)]在 EMT和纤维化形成中起关键作用。参与TGF-β1诱导的EMT下游分子包括smad2、smad3、smad4和smad7，而TGF-β1激活下游介质(包括Smad2和Smad3)发挥的生物学效应受Smad7表达的负调控。在病理条件下，Smad2和Smad3表达上调，而Smad7表达下调。TGF-β1/Smad级联由三元信号复合物组成，当TGF-β1与TGFβRII相互作用时被激活，TGF-βRII磷酸化TGFβRI，进而使细胞质介体即Smad2和/或Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2/3与Smad4形成异源三聚体复合物，该复合物易位至细胞核结合共有序列，调节目的基因转录[6]。

TGF-β1是纤维化和炎症发展的关键介质，是一种稳态因子，起一定的免疫监视作用，并协调所有器官受伤或感染后复杂组织修复过程[7]。TGF-β1在正常生理条件下可以抑制EMT的发生以及上皮细胞和成纤维细胞的增殖，但在恶性肿瘤条件下却可以刺激转化的上皮细胞生长，因为在肿瘤早期受TGF-β1抑制的具有转移潜能的癌细胞随着疾病发展逐渐逃避了这种抑制作用，反而利用转化生长因子来驱动转移[8]。因此，TGF-β1在同一细胞上发挥何种作用主要取决于周围微环境。众所周知，子宫内膜异位症是一种复杂的慢性炎症性疾病[2]，并且经历反复损伤和修复[9]。病变所在微环境出现缺氧、炎症因子或者血小板聚集都会促进异位内膜间质细胞合成、分泌TGF-β1，使其在EMs 患者腹腔液和异位内膜病灶处高表达[10]，TGF-β1可以使盆腔微环境呈现出一种免疫耐受状态，通过TGF-β1/Smad信号通路促进EMs疾病的发展[7]。

动物实验表明，激活 TGF-β1/Smad 信号通路，异位病灶中上皮细胞标志蛋白上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)表达下降，而间质细胞的标志蛋白波形蛋白(Vimentin)表达升高[11]，因此认为，内异症中存在 EMT 过程，使ECM分泌过度并沉积从而导致粘连。另有学者进行体外实验，纳入42位卵巢子宫内膜异位囊肿患者的卵巢囊肿壁的切片作为实验组，29位成熟畸胎瘤患者的瘤壁的切片作为对照组，Masson’s染色提示实验组与对照组相比有明显的纤维化；此实验又利用免疫组织化学染色、免疫印迹分析以及荧光原位杂交的方法确定了是子宫内膜异位细胞特异性地合成了 TGF-β1，并且引起实验组Smad2 和Smad3以及相关纤维蛋白阳性表达，从而明确了TGF-β1/Smad信号通路的促纤维化作用[12]。Zhang等[13]发现组织损伤后，来自受损或血管渗漏的活化血小板可以诱导子宫内膜异位细胞发生EMT及FMT改变，从而发生大量ECM沉积，并且与活化血小板共培养后TGF-β1的基因和蛋白质表达以及磷酸化的Smad3(而非总的Smad3)水平显著升高。随后此团队用抗血小板药物干预，造成TGF-β1/p-Smad3表达降低，引起TGF-β1/Smad通路活化减弱，导致异位病变大小、EMT、FMT和纤维化程度降低[14]。此外，越来越多的证据表明，缺氧参与子宫内膜异位症的形成，缺氧的主要调节因子HIF-1α在子宫内膜异位病变中过表达[15]，内异症小鼠模型中可检测到较高的HIF-1α、TGF-β1和整联蛋白表达，并且在人造缺氧环境中添加TGF-β1受体抑制剂，可以抑制子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells，ESC)的粘附，沉默HIF-1α可以减弱TGF-β1/Smad信号的激活和整联蛋白的表达，进而降低了ESC的粘附，最终得出低氧微环境可以通过刺激ESC产生过量的TGF-β1并激活TGF-β1/Smad信号通路增强整联蛋白的表达和ESC的粘附能力[16]。

二、Wnt/β-catenin信号通路

细胞膜上的Wnt受体与不同配体结合后可激活下游经典或非经典信号通路。Wnt/β-catenin通路作为高度保守的经典Wnt细胞信号通路。在没有Wnt配体的情况下，β-catenin会被APC/Axin/GSK-3β复合物降解。Wnt配体与卷曲跨膜蛋白受体(FZD)及其低密度脂蛋白相关受体(LRP)结合导致糖原合成激酶3β(GSK-3β)去磷酸化而失活，同时抑制细胞质中的β-catenin降解，升高的胞质β-catenin转运至细胞核与转录调控因子——T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)家族成员相互作用，诱导靶基因的转录激活[17-18]。

子宫内膜异位症所致纤维化受Wnt信号通路的调节[19]。Matsuzaki等[20]通过体外靶向异位子宫内膜间质细胞中的Wnt/β-catenin途径，可显著降低α-SMA、Col-1、CTGF和FN mRNA的表达，并且在建立的小鼠模型中使用Tcf/β-catenin复合物的小分子拮抗剂，不仅可抑制子宫内膜异位症中成纤维细胞迁移、增殖和胶原蛋白收缩，而且具有逆转已存在的纤维化病变的效果。另有文献提出，从子宫内膜间充质干细胞获得的条件培养基可以通过经典Wnt/β-catenin通路显著增强成纤维细胞的存活，促进细胞因子和ECM的产生或分泌，并对Wnt1促进异位病灶纤维化作用进行了动物实验的验证[21]。2018年Shao等[22]发现EMs异位子宫内膜间质细胞中FOXP1基因表达上调，用siRNA沉默FOXP1会降低Wnt信号传导活性和纤维化标记基因(CTGF、Col-1、α-SMA和FN)的表达，而过表达FOXP1会增强Wnt/β-catenin信号传导以及间质细胞的增殖和迁移，这一作用又可被Wnt信号抑制剂XAV939阻断，证明FOXP1是通过Wnt/β-catenin信号通路参与子宫内膜异位症的纤维化。

已知基质金属蛋白酶(MMPs)是一类调节成纤维生长因子和细胞外基质蛋白降解的主要蛋白酶，纤维化的发展与MMPs和组织蛋白酶抑制剂(TIMP)之间的失衡有关[23]。体外研究发现，雌激素在EMs中可激活Wnt/β-catenin信号通路，间接调节MMP9的表达和活性[24]。此外，血管内皮生长因子(VEGF)作为Wnt/β-catenin通路的下游靶基因，其表达受β-连环蛋白调节，在雌激素激活Wnt/β-catenin通路作用下，EMS异位子宫内膜基质细胞中VEGF表达增加有利于异位病灶新血管的形成[25]。另有研究表明，Wnt1、TGF-β1、VEGF、MMP和其他细胞因子之间的平衡与从血管生成向纤维化的转变有关[26]。最近，在子宫内膜异位症的临床前模型中发现，ICG-001和C-82可以通过特异性结合环状AMP反应元件结合蛋白CREBBP(CBP)来抑制β-catenin/TCF信号传导，这项研究认为抑制Wnt/β-catenin信号通路是改善纤维化和逆转子宫内膜异位病变的有吸引力的治疗靶标[27]。

三、Notch 信号通路

Notch信号通路进化保守，可调节细胞增殖、侵袭、分化和凋亡[28]，以上每一个过程都在子宫内膜重构中发挥重要作用。在哺乳动物中，Notch信号家族包括4个Notch受体(Notch1～4)、5个配体，其中3个Delta-like蛋白(DLL1、3、4)和2个锯齿蛋白(JAG1，2)。Notch受体和配体都是单向跨膜蛋白，因此，Notch信号通路在细胞与细胞接触后被激活[29]。Notch受体激活后发生分裂，释放NICD(Notch蛋白的活性形式)，NICD易位进入细胞核，直接参与导致纤维化的核靶基因的转录调控[30]。

Notch信号通路在其它疾病和器官纤维化中的作用已被证实，如作为典型的纤维化疾病的系统性硬化症。Wasson等[30]研究表明，Notch信号通路的激活可以促进肌成纤维细胞活化产生Col-1和α-SMA等纤维蛋白，进而引起系统性硬化症的皮肤和内部器官的组织和血管纤维化。但是Notch信号通路在内异症纤维化中的研究较少。González-Foruria等[31]发现，子宫内膜异位症患者的Notch通路过度激活可引起纤维化标记物如α-SMA和Col-1高表达，促进病灶纤维化，但是用DAPT和FLI-06(阻止Notch裂解和NICD释放的γ-分泌酶抑制剂)处理后可减少异位子宫内膜基质细胞的纤维化。González-Foruria的研究正如在其他促纤维化疾病中已经观察到的一样，证明Notch信号通路在内异症纤维化过程中同样起着重要作用。另有研究表明，EMs 中Notch 信号通路的激活可发生EMT，上皮细胞经过EMT后失去了细胞极性和细胞间联系，不仅具有间质细胞的侵袭力和迁移力，还具有间质成纤维细胞分泌ECM的特性，进而有利于纤维化的形成[32]。

四、与子宫内膜异位症纤维化相关的其它信号通路

Nasu等[33]的体外实验发现，异位子宫内膜间质细胞中胶原蛋白收缩性增强，α-SMA、RhoA、ROCK-I和ROCK-II蛋白表达均增加，肝素的应用可明显减弱胶原蛋白收缩，抑制EMs纤维化相关蛋白表达，认为 Rho/ROCK 通路的激活可能参与EMs 相关的纤维化发生。此外，核因子κB(NF-κB)作为一种模式识别受体，可与高迁移率族蛋白(HMGB1)结合促进EMs 纤维化发展[34]。炎症因子白介素6(IL-6)基因启动子上有 NF-κB的结合位点[35]，而且 IL-6诱导的Notch1表达可促进子宫内膜异位病变的发展[36]，由此可推断NF-κB信号通路和Notch 信号通路在EMs 纤维化发生中可能存在交叉作用。另有文献提出，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和Janus激酶/信号转导与转录活化因3(JAK/STAT3)通路在EMs发病机制中也起重要作用[19]。值得注意的是，Rho-ROCK通路、NF-κB通路、MAPK通路、JAK/STAT3通路与EMs纤维化发生相关的机制研究较少，未来应重视此方面研究对临床工作的指导意义。

5、总结与展望

各种疾病中存在的纤维化问题日益突出，但是纤维化发生机制以及如何治疗纤维化仍未得到阐明和解决。随着分子生物学的发展，对EMs纤维化的分子基础有了更深层次的了解，本综述着重提供了与子宫内膜异位症纤维相关的TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin、Notch 信号通路的系统评价。因为TGF-β1在生理状态下对机体的生长发育起着同样重要的作用，所以直接靶向TGF-β1不太可能产生可行的抗纤维化疗法，那么从促纤维化的微环境着手进行抗纤维化治疗或许可行，如抗血小板治疗。此外Wnt/β-catenin信号通路抑制剂的抗EMs纤维化作用在动物模型中已见成效，但是毕竟动物模型无法准确反映人类EMs的状况而且腹膜内给予的高剂量抑制剂可能与临床剂量不符，所以仍需要更多的临床前基础研究提供支持性数据。Notch信号通路相关的上下游分子机制在EMs纤维化中的作用还需要更多体外或动物实验进行探究。本综述虽然以单个信号通路的形式进行阐述，但是EMS纤维化的发生是一个多因素、多阶段、受多基因调控的复杂过程，各个信号通路之间并非完全独立发挥作用，而是构成一个复杂相互作用网络，这使得EMS纤维化的治疗变得更加复杂，所以多靶点联合用药抗纤维化也将成为治疗的热点研究方向，为抗EMs纤维化治疗开拓一个广阔的前景。总之目前的研究现状对未来针对EMs纤维化的应用既提供了思路也提出了特别的挑战。