辅酶Q10生物合成代谢调控策略研究进展

杜家文，黄建忠，江贤章

（福建师范大学工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建师范大学生命科学学院，福建福州 350117）

辅酶Qn（CoQn），也叫泛醌（Ubiquinone），是一类脂溶性醌类化合物，具有很强的抗氧化能力；由一个醌环与不同数目的异戊烯侧链组成，其苯醌结构可以可逆地还原为对苯二酚化合物，是呼吸链中的氢传递体。侧链异戊烯的个数（n）决定了辅酶Qn的种类。人体中，辅酶Q10是参与线粒体内膜呼吸链电子传递的重要组分，在降低自由基伤害、改善心肌细胞、预防心血管疾病中起到重要作用[1]。本文根据近年来国内外关于微生物辅酶Q10代谢调控策略进行综合论述。

1 诱变筛选

化学诱变是微生物育种的重要手段，将辅酶Q10的生产菌株进行化学诱变后，在加有辅酶Q10合成途径抑制剂或呼吸链电子传递抑制剂的培养基中进行筛选，可以选育出辅酶Q10的高产菌株。例如，将根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）化学诱变后，分别涂布至加有道诺霉素和甲萘醌（辅酶Q10结构类似物）、L-乙硫氨酸（甲硫氨酸前体类似物）、芳香族氨基酸合成以及电子传递链抑制剂的平板上，成功获得了高产Q10的根癌土壤杆菌[2]。另外，在可以产生胡萝卜素的辅酶Q10生产菌株中，有研究发现胡萝卜素产量的降低可以导致辅酶Q10产量的升高。其原因可能是胡萝卜素降低后，细胞内需要合成更多的辅酶Q10来增加细胞的抗氧化能力，免受自由基的伤害；也可能是胡萝卜素降低使得两者共同的中间体异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）被更多地用于合成辅酶Q10。

2 增加辅酶Q10的前体

2.1 增加异戊烯前体

增加异戊烯前体是提高辅酶Q10的有效手段。大肠杆菌中通过强化表达2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）合成途径上的关键限速酶[2]基因可以有效提高其辅酶Q10的生产水平。MEP途径的第一步是由1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶（DXP合成酶）催化3-磷酸甘油醛（G3P）和丙酮酸缩合生成DXP的反应。有研究报道在可以合成胡萝卜素、番茄红素的转基因大肠杆菌中，增加DXP合成酶基因的表达水平，可有有效提高胡萝卜素、番茄红素的产量[3]。使用同样的策略在可以合成辅酶Q10的转基因大肠杆菌中，过表达来源于假单胞菌绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）的DXP合成酶基因，使辅酶Q10的产量比对照菌株提高了1.8倍[4]。

2.2 增加芳香环前体

在细胞中提高芳香环前体的供应是提高辅酶Q10产量的另一有效方法。由分支酸途径合成的对羟基苯甲酸（pHBA）是辅酶Q10的母核，分支酸裂合酶（UbiC）是将分支酸转化为pHBA的酶。除了转化为pHBA，分支酸还是细胞体内合成苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、叶酸、维生素K2等化合物的前体物质。因此细胞内UbiC酶的含量决定了分支酸代谢的走向。产辅酶Q10的转基因大肠杆菌中，在过表达多聚异戊烯转移酶（UbiA）的同时，增加UbiC的表达量可以有效增加辅酶Q10的产量[5]。在锁掷酵母（S.johnsonii）的研究中发现，在培养基中添加pHBA即可使其辅酶Q10产量提高8倍[6]。然而，体外添加pHBA对大肠杆菌辅酶Q10的产量却几乎没有影响[7]。以上研究表明，在异戊烯前体供应充足的前提下，通过提高UbiA的表达水平，或者提高细胞对pHBA的摄取量可以使分支酸的代谢流向辅酶Q10合成方向，从而增加辅酶Q10的产量。

2.3 过表达泛醌修饰途径基因

在可产生辅酶Q10的重组大肠杆菌中，由泛醌修饰途径上的基因UbiA催化的多聚异戊烯侧链与pHBA之间的缩合反应是合成辅酶Q10的关键限速步骤[2]。与仅仅过表达十聚异戊烯焦磷酸合成酶（DPS）的大肠菌株相比，共同过表达UbiA与DPS的菌株中，辅酶Q10产量提高了3.4倍[5]。然而，在大肠杆菌中过表达其他泛醌修饰途径上的基因UbiB、UbiG及单加氧酶(UbiH)，对辅酶Q10产量并没有显著影响[5]，这可能是pHBA或异戊烯前体供应不足所致。

3 调控中心代谢提高辅酶Q10产量

与辅酶Q10一样，番茄红素合成的前提物质也是异戊二烯。有研究发现，通过中心代谢调控，使碳代谢流转向番茄红素合成途径，可以在重组大肠杆菌中显著提高番茄红素的产量[7]，同样的策略也可应用于增加辅酶Q10的合成。另一种策略是通过平衡中心代谢的还原力来增加辅酶Q10的合成量。例如，研究表明在根瘤菌R.radiobacter中，NADH/NAD+比例的升高是其高产辅酶Q10的重要原因[8]，基于这一发现，通过过表达NAD+依赖的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GapA），使NADH/NAD+的比例提高25%，可以成功将辅酶Q10的产量提高2倍[8]。

4 优化培养条件提高辅酶Q10产量

许多研究表明，发酵过程中降低培养基中的溶氧浓度，可以提高R.radiobacter和R.sphaeroides的辅酶Q10产量[9]，例如将溶氧由20%降到5%，R.radiobater的辅酶Q10产量提高了4倍[10]。为了研究这一现象背后的机制，人们利用细胞色素c氧化酶的抑制剂叠氮化合物和解偶联氧化磷酸化试剂（2,4-二硝基酚，DNP）对细胞进行处理，结果发现随着培养基中叠氮钠浓度的升高，辅酶Q10浓度也随着升高。然而，DNP对辅酶Q10的积累并没有效果，这一结果表明降低氧供应引起的Q10产量提高的原因并不是由于细胞质子梯度变化，而是限氧本身引起。

5 展望

迄今为止，通过诱变和选择抑制剂分离菌株已被证实是提高辅酶Q10产量的最成功策略。但是，由于选择抑制剂培养基上筛选的菌株与辅酶Q10产量之间没有直接的关系，运用这种方法很难再进一步提高辅酶Q10产量。通过对自然界中高产辅酶Q10的菌株进行对比分析，可能会得到有价值的线索，并应用于基因工程菌株的改造。