血流感染的分子诊断研究进展

金君 孙仁华 呼邦传

[摘要] 血流感染是指病原微生物进入血液循环并生长繁殖，产生毒素、代谢产物，导致全身炎症反应的感染性疾病，是当前全世界临床医生面临的重大挑战之一。早期诊断并使用有效的抗感染方案能缩短抗生素使用时长、降低患者死亡率。血培养及药物敏感试验是目前临床诊断血流感染的金标准，但其存在病原学检测结果时间长、阳性率低等缺点，不能满足血流感染危重患者快速及精准治疗的需求。近年来随着分子检测技术的发展，涌现出DNA微阵列、质谱分析、数字PCR、二代高通量测序等分子诊断技术，较血培养能更快速地识别病原菌及耐药基因、提高检测的阳性率，指导临床医师早期进行目标抗生素干预，对改善血流感染患者临床预后具有潜在价值，并可降低病原菌耐药性。

[关键词] 血流感染;血培养;分子诊断技术;研究进展

[中图分类号] R631          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）36-0182-06

[Abstract] Bloodstream infection is an infectious disease in which pathogenic microorganisms enter the blood circulation， and grow and multiply， producing toxins and metabolites leading to systemic inflammation. It is one of the major challenges faced by clinicians all over the world. Early diagnosis and effective anti-infection regimens can shorten the duration of antibiotic use and reduce the mortality of patients. Blood culture and drug sensitivity test are the gold standards for clinical diagnosis of bloodstream infection， but they have disadvantages such as the time-consuming detection results of etiology and the low positive rate， which cannot meet the needs of rapid and precise treatment for critically ill patients with bloodstream infection. In recent years， with the development of molecular detection technology， DNA microarray， mass spectrometry， digital PCR， second-generation high-throughput sequencing and other molecular diagnostic technologies have emerged. Compared with blood culture， these techniques can quickly identify pathogenic bacteria and drug-resistant genes， improve the positive detection rate， guide clinicians to conduct targeted antibiotic intervention in the early stage， and have potential value in improving the clinical prognosis of patients with bloodstream infection， and in the long run， reduce the resistance of pathogenic bacteria. Therefore， this paper reviews the research progress of molecular diagnostic techniques for bloodstream infection.

[Key words] Bloodstream infection; Blood culture; Molecular diagnostic technique; Research progress

近年來，血流感染（Bloodstream infection，BSI）的发病率呈上升趋势，这与重症病房侵入性操作多、广谱抗生素使用不合理、多重耐药菌的增多及人口老龄化等因素相关。Lamy等[1]的调查研究数据显示，全球每年BSI患者高达3150万人，BSI已成为欧洲和北美国家人群的七大死因之一。近20年来，发达国家的BSI患病率达334/10 000～571/10 000，死亡率高达27%～36%[2]。美国流行病调查数据显示，2010年～2015年美国因BSI入院患者的比例从3.9%上升至9.4%，并导致每年近8万人死亡;欧洲报道每年有近120万例BSI发生，可导致15.7万患者死亡。Zhou等[3]对2017年北京公共卫生信息中心数据库的调查研究显示，当年BSI在北京的发病率达461/100 000，死亡率为79/100 000，根据当年全国人口推算，全国每年新发BSI例数达486万人，死亡例数为83万人。相较于普通病房，BSI在ICU中的发病率及病死率显著增加。谢剑锋等[4]对全国ICU患者的BSI流行病学进行调查分析，研究显示BSI发病率在ICU中高达20.6%，形势非常严峻。

早期检测致病菌、合理使用抗菌药物，能显著改善BSI患者的预后。研究显示，脓毒症患者每延迟目标抗生素治疗1 h，死亡率增加7.6%;而延迟抗生素治疗6 h，死亡率增加58%[5]。在入住ICU未接受有效抗生素治疗的BSI患者中，其60 d死亡率高达88%[6]。尽管目前BSI诊断的金标准为血培养和药敏试验，但其仍存在较多的局限性，如检出阳性率低，报告结果时间长达24～72 h。此外，对多种病原菌混合感染进行血培养时，还额外需要24 h进行亚培养。研究显示，对BSI患者采用经验性抗菌治疗策略，可能导致多重耐药病原体的选择和传播，并增加侵袭性真菌感染的发生率[7]。因血培养很难对BSI进行早期诊断，常会导致诊断错误或抗生素治疗强度不足，对一些疑似BSI的患者而言可能致命[8]。因此，需要建立一种快速提供病原菌及耐药信息的检测方法，为目标抗生素治疗方案提供实验室依据，从而达到精准治疗的效果。近年来，随着分子检测手段的发展，用于快速诊断BSI病原菌的方法层出不穷，这些分子诊断技术被用于补充血培养的不足，可分为基于阳性血培养样本病原菌检测和全血中直接检测病原菌的检测方法。前者包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析、荧光原位杂交技术、多重PCR技术、DNA微阵列技术等;后者包括实时定量PCR、二代测序技术、T2磁共振检测技术、数字PCR技术等。

1 基于阳性血培养样本的检测方法

1.1 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）

MALDI-TOF MS运用不同细菌、真菌间存在特异性蛋白质谱峰的原理鉴定病原菌，该技术将待测样本转化为运动的离子，在磁场作用下这些离子因不同的质荷比分离，检测仪记录这些电离的强度并形成特异性质谱图，与数据库匹配后得到检测结果。该技术在血液培养阳性后进行检测，可检测包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌及真菌在内的多种微生物，一般较常规血培养结果早18～48 h，同时还可检测超广谱β-内酰胺酶和碳青酶烯类耐药基因[9]，基于该法的VITEK MS系统还可用于鉴别诺卡菌、分枝杆菌和丝状真菌。该技术方法可靠，能快速诊断单种菌阳性血培养瓶中的病原菌，准确率达71%～96%[10-11]。众多研究显示，利用MALDI-TOF MS技术可快速提供有效的微生物学信息，对病原菌进行快速诊断，据此，临床医师能更早地调整抗生素方案，可使患者的住院时间缩短2～6 d，死亡率降低4%～9%[12-14]。但该技术仍存在局限性，针对多菌感染的研究显示，该法能检测85.7%的病原菌[15]，不能鉴定混合培养基中的所有微生物，这可能与同一选择性培养基生长的不同微生物量较少有关，其对真菌及链球菌检测的效果较差，且抗生素应用会影响其鉴定的准确性。此外，该技术鉴定微生物依赖已知的数据库，检测的准确性受其数据库影响，但随着数据库的不断完善，更多微生物及细菌耐药性将被识别，该技术的临床诊疗价值也会随之增加。

1.2 荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）

熒光原位杂交是通过荧光素标记的寡核苷酸探针特异性结合靶病原体基因组中的核糖体DNA（rDNA）区域，即细菌的16S rDNA基因或真菌的18S rDNA基因，通过荧光显微镜观察探针和互补序列之间特异性结合，获得细胞核内染色体或基因信息的技术，不依赖病原物质的扩增。肽核酸荧光原位杂交（Peptide nucleic fluorescent in situ hybridization，PNA-FISH）是利用肽核酸探针（PNA）与生物特异性rRNA杂交，并通过荧光显微镜进行检测，直接从阳性血培养瓶中检测常见的病原菌，其根据革兰染色结果选择特异性探针，包括葡萄球菌探针（金黄色葡萄球菌、CoNS）、肠球菌探针（粪肠球菌、屎肠球菌）、革兰阴性细菌探针（大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌）和酵母探针（白色念珠菌、光滑念珠菌、副念珠菌、假丝酵母菌）。该技术常用Accelerate pheno system，该系统能在7 h内全自动地从阳性血培养样本中快速识别病原菌及耐药信息，诊断准确率达88.7%～100.0%[16]。有研究显示，该技术联合抗生素管理方案时，能明显降低BSI患者的住院时间及住院死亡率，在无明确的抗生素管理方案时，则可能掩盖快速诊断带来的优势，导致上述临床指标没有明显改善[17]。PNA-FISH的缺点是检测依赖较高的病原数，检测限达105 CFU/mL，血液中病原菌数量较少时不易检出。快速荧光原位杂交技术（QuickFISH assay）是多色质核酸杂交技术，检测速度较PNA-FISH更快，操作更简便快速，大大提高了检测效率，其敏感性高达97.1%～100.0%，特异性为89.5%～100.0%[18-20]。Koncelik等[18-20]利用QuickFISH在30 min内鉴别金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌，平均检出时间、BSI患者住院时间、万古霉素使用时间均较血培养显著缩短，并且接受QuickFISH检测的患者还可节省总体住院费用，提示其在金黄色葡萄球菌感染鉴定中具有价值。此外，QuickFISH在鉴别不同真菌感染中也具有重要意义，能鉴别最常见的白念珠菌、副念珠菌及光滑念珠菌[21]。该技术仍存在一些局限，由于探针数量限制，只能识别常见病原菌，不能识别所有病原菌，且其不能提供药敏信息，限制了其在临床上的应用。

1.3多重PCR技术

多重PCR技术是指在同一PCR反应体系中加上多对引物，同时扩增出多个核酸片段的反应，该技术鉴别速度快，可在同一反应内同时检测多种致病菌及耐药基因，可识别24种病原菌，包括19种细菌、5种念珠菌，能检测出甲氧西林（mecA）、万古霉素（vanA/B）和碳青霉烯（blaKPC）耐药基因。FilmArray blood culture identification（BCID）是自动化多重PCR平台，集核酸提取、纯化扩增、检测和分析为一体，可以在1 h内从血培养阳性的血样本中识别病原菌，覆盖90%以上的BSI致病菌。多项随机对照研究显示，应用该系统较血培养能更早获得病原学信息，可更早对疑似BSI患者进行目标性抗菌治疗，但其对临床预后如死亡率、住院时间的改善不明显[22-23]。Kang等[24]的研究结果显示，该系统鉴定BSI病原菌总体敏感性可高达94.6%，在多重感染中敏感性则降至78.6%，提示其识别多重菌感染的敏感性不高，不能获得所有病原菌信息。该技术对金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌的mecA基因检测容易产生假阳性的结果，各项诊断研究中针对念珠菌感染的样本较少，故需要更多大样本研究以验证其价值。

1.4 DNA微阵列

DNA微阵列利用光导化学合成、固相表面化学合成等技术，在固相表面形成成千上万个寡核苷酸探针，与放射性同位素或荧光标记的DNA或cDNA杂交，可识别目的基因及检测基因表达水平，能同时检测多个病原体及耐药基因。目前临床已使用Verigene BC-GP、Verigene BC-GN核酸检测技术，分别检测革兰阳性菌和革兰阴性菌。BC-GP可检测出12种革兰阳性菌和3个耐药基因，灵敏度达97.1%，特异度达100.0%;BC-GN能识别9种革兰阴性菌和6种耐药基因，灵敏度达98.0%，特异度达100.0%，两者检测时间仅需2.5 h。已有研究显示，该技术能使疑似BSI的患者更早接受有效及最佳治疗，缩短住院时间、降低住院死亡率[25]。有研究采用2 d抗生素变化率指标衡量该技术对BSI患者的临床效益，提示该法能快速提供病原信息、提供抗生素更改依据，在BSI患者抗生素方案指导上有重要意义[26]。该技术的局限是对混合菌感染检测效果不佳，其主要原因为靶病原菌数量不足。且该技术依赖准确的革兰染色结果，如染色结果不准确导致选择了不对应的系统，则会出现假阴性结果。

2 基于全血直接检测的方法

2.1 实时定量PCR（Real-time PCR，qPCR）

实时定量PCR技术可直接在全血中检测病原菌，免去血液培养这一耗时步骤，常见的如SeptiFast系统，使用针对细菌16S rDNA和真菌18S rDNA区域的通用引物进行广谱核酸扩增，然后对来自阳性血样本的扩增产物进行测序，能在6 h内检测出包括6种真菌在内的25种病原体，同时还可检测mecA耐药基因，该技术可检测小于1 mL的血标本，避免了血培养需大量采集血液的缺点，对真菌的检出限为100 CFU/mL，细菌的检出限达3～30 CFU/mL[27]。研究显示，SeptiFast系统较血培养阳性检出率高13倍，且不受抗生素应用的影响，对多种微生物感染的鉴定较血培养更有优势[28]。该法虽有减少检出时间等优势，但其整体敏感性不高，在大樣本研究中，其敏感性仅有50%[29-30]，可能与血液中病原菌低于检测限、靶DNA序列变异有关。既往随机对照研究显示，基于SeptiFast检测的患者抗生素方案调整更迅速，能够缩短抗菌药物使用时间，但对患者的生存预后并无显著改善，且不能获得除mecA以外的耐药基因信息，因此该法在临床上的应用仍存在局限[31]。Xpert MRSA/SA也是基于该技术的系统，主要通过检测spa基因、mecA基因及金黄色葡萄球菌盒式染色体（SCCmec）在金黄色葡萄球菌的插入位点来鉴别MASA，其缺陷为引物和探针结合区存在突变或多态性可能会影响鉴定准确性。研究显示，该系统检测能降低患者住院时间，但对降低患者住院死亡率证据不足。考虑到目前研究的样本量有限，仍需进一步进行大型多中心研究明确该方法带来的临床效益。

2.2二代测序技术（Next-generation sequencing technology，NGS）

NGS也被称为高通量并行测序，可快速对样本中全部DNA或RNA进行测序，能一次性对多个靶基因进行检测，具有敏感性及特异性高、所需样本量小等优势。目前认为NGS作为一种新的BSI致病微生物检测方法，Horiba等[32]的研究显示，NGS能在BSI发病前7 d检测到血液中的致病菌，提示该方法能够提前预测患者发生BSI的潜力。另有小样本研究提示，NGS技术检测阳性率是血培养的6倍，可致53%抗生素方案改变，即使不能获得耐药信息，也能带来临床获益，如缩短患者住院时间、降低患者住院死亡率等[33]。同样，NGS也存在局限性，如检测费用高、周期相对长、不能检测耐药基因、需要专业团队等，尤其是检测报告时间常需要2～3 d，但其对临床少见菌的鉴定和新菌种的发现方面更具优势。

2.3 T2磁共振检测（T2 magnetic resonance，T2MR）

T2MR是利用核磁共振（NMR）技术直接检测全血中的病原菌，其原理是对病原体进行特异性核酸扩增，然后将扩增产物与富含探针的超顺磁性纳米颗粒杂交，杂交会导致纳米粒子聚集，如检测到样本的T2MR信号变化，提示存在待检测的病原菌。所有步骤包括细胞裂解、靶DNA扩增、扩增产物T2MR检测，均由T2Dx仪器自动完成，该技术具有较高的临床敏感性，能检测到样本中极少量的靶核酸，检出限达1～3 CFU/mL，优于PCR技术。一项纳入140例疑似BSI患者血标本的研究[34]比较了血培养和T2MR检测方法，结果显示，T2MR技术检测敏感性和特异性分别为83.3%和97.6%，报告结果时间仅需4～7 h，明显优于血培养。该技术除能检测5种最常见的BSI细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌）外，基于该技术的T2Candida还能检测5种念珠菌（白色念珠菌、光滑念珠菌、副念珠菌、热带念珠菌和假丝酵母菌）。DIRECT2试验提示其灵敏度达89%，且不易受抗真菌治疗的影响，该方法对缩短念珠菌检测、菌种鉴定时间及改善真菌感染患者预后有重要意义[35]。但该技术存在局限，如检测到病原菌种类较少、不能提供药敏信息，且检测费用昂贵，导致其临床应用困难，未来仍需更多研究克服上述局限性，发现改善BSI患者临床预后的潜力。

2.4 滴液数字PCR技术

滴液数字聚合酶链反应（Droplet digital PCR，ddPCR）是不依赖额外标准曲线对目标序列进行绝对定量的分子诊断技术。ddPCR技术将样本分割成数万个微滴，利用微滴分析仪对每一个扩增后的微滴进行检测，通过记录的荧光信号幅度判断微滴是否含待检测的核酸靶分子，从而实现核酸靶分子的绝对定量。Wouters等[36]通过ddPCR技术检测疑似BSI患者的血液样本，发现该技术能在4 h内鉴别阴性或阳性细菌、真菌，且认为ddPCR较其他分子诊断技术如SepsiTest具有更高的敏感性，适合极低含量目标片段定量或定性检测。但该技术鉴别真菌的敏感性相对较低，且该研究采用泛细菌、真菌引物，因此未能确定具体菌属及药敏信息。Zeng等[37]使用ddPCR技术，通过对引物的设计可进一步确定菌属及耐药信息;通过设计针对CpsE基因的ddPCR引物识别无乳链球菌，发现ddPCR具有高度敏感性、特异性及良好的重复性。Abram等[38]研发了名为IC3D的快速诊断系统，集合了ddPCR检测技术和高通量三维粒子计数系统，可在1 h内对全血标本进行细菌鉴定和药敏分析，检出限达10 CFU/mL，对比报道中的qPCR检出限1000 CFU/mL，具有更高的敏感度。该方法存在一定的局限性，如ddPCR检测基于荧光探针，对引物特异性较高，且选择不同的靶基因会影响检测有效性，其高敏感度可能造成假阳性结果，且目前仍需大型研究将ddPCR技术应用到临床BSI抗生素管理中，以明确其潜在的临床价值。

综上所述，当前BSI的高发生率和高死亡率已得到广泛关注。就诊断而言，血培养仍是诊断BSI的金标准，但血培养在快速诊断和检测阳性率低方面仍存在局限性。目前研究显示，分子诊断对BSI病原学诊断具有较大潜力，随着对微生物基因组学的深入了解和分子诊断技术的发展，相信未来人们能够在数小时内同步快速识别病原体及其耐药基因。多种检测技术联合应用，可以提供可靠的BSI诊断结果，有效指导临床合理用药、及时诊治、早期精准地优化抗感染方案、有效提高BSI患者的生存率。分子技术将成为BSI诊治必不可少的重要工具。

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（收稿日期：2020-10-10）