羧甲基壳聚糖对铀的促排及肠道菌群的影响

姚亦天，吴梓茹，欧阳杰，张晓燕，李仁艳，李 昊，潘媛媛，黄德娟

(东华理工大学 化学生物与材料学院，江西 南昌 330013)

铀的毒性表现在化学毒性和放射性毒性两方面。人体摄入铀的途径主要有吸入含铀气溶胶、摄入被铀污染的水或食物；植物方面，铀溶液能对大豆幼苗细胞DNA造成损伤，影响其萌发率、生根等[1]；动物方面，长期接触低剂量铀，动物会发生基因突变，生殖功能和造血系统也会受到损害，铀主要会对蓄积器官(肾脏、骨组织)及敏感器官(睾丸)产生毒害。

人体肠道内微生物数量达100万亿个[2]，超过1 250种，统称为肠道菌群。这个巨大而复杂的微生物群落从消化、营养吸收、能量供给、免疫调节和抵抗疾病等多方面影响人和动物的生理与病理状况[3]。调整肠道菌群失调的较好方法是益生元补菌，促进双歧杆菌、乳杆菌等肠道有益菌的增殖，维持肠道菌群平衡。多糖类物质因能够增强肌体健康、延缓细胞衰老而得到广泛研究[4-5]。重金属的摄入会造成动物和人体肠道菌群结构发生特异改变；反之，肠道菌群及其代谢产物又为宿主抵御重金属进入肌体提供“屏障”功能[6]。

壳聚糖(chitosan)是自然界中唯一的碱性多糖，主要来源于节肢动物、软体动物的外壳及真菌的细胞壁，无毒无害，生物相容性好，具有抗肿瘤和增强肌体免疫功能的作用，可以抑制真菌、酵母菌和细菌等的繁殖[7]；同时壳聚糖能与铀形成螯合物[8]。但壳聚糖不溶于水，使其应用受到很大限制，其衍生物羧甲基壳聚糖在水溶性及生物活性等性能方面都有提高[9]；但羧甲基壳聚糖对体内铀染毒的解毒效果尚未见有报道。因此，从小鼠体质量变化、体内菌群数量、肝肾中铀含量等方面研究羧甲基壳聚糖对染铀小鼠的解毒效果，以期为铀解毒提供安全无害的方法，也为进一步开发壳聚糖的生物活性提供新思路。

1 试验部分

1.1 动物、试剂与仪器

SPF级昆明小鼠48只，雄性，6～8周龄，体质量30～40 g，购于南昌大学抚州医学分院。

0.2 mg/mL铀溶液，偶氮胂Ⅲ，盐酸，乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)，无水乙醇，浓硝酸，过氧化氢溶液，生理盐水，质量分数为10%的羧甲基壳聚糖，LBS(乳杆菌)培养基，EMB(大肠杆菌)培养基，BS(双歧杆菌)培养基，EC(肠球菌)培养基。

可调式电热板，手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅，紫外可见分光光度计，净化工作台，光照培养箱，台式离心机，电子天平，生物解剖器，电热鼓风干燥箱，聚四氟乙烯坩埚。

1.2 试验方法

1.2.1 分组与处理

将48只小鼠随机分为3组，每组各16只。

空白组：腹腔注射生理盐水2周+灌胃生理盐水2周；

中毒组：腹腔注射铀溶液2周+灌胃生理盐水2周；

试验组：腹腔注射铀溶液2周+灌胃羧甲基壳聚糖2周。

每周结束后，3组各解剖4只，通过3组间相互对照，观察铀对小鼠的毒害作用及羧甲基壳聚糖的解毒效果。

1.2.2 体质量称量

每天在喂食前称量各小鼠体质量，观察不同组别间小鼠的外貌特征(如眼睛、皮毛)。

1.2.3 肠道微生物的培养

每2～3 d收集一次鼠便，梯度稀释，在超净工作台中涂布接种4种主要肠道微生物(双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌、肠球菌)，放入培养箱中于37 ℃下培养48 h。

1.2.4 肝肾中铀质量分数测定

每周解剖一批小鼠，取其肝肾，用分光光度法在652 nm波长下测定铀的吸光度，再推算铀质量分数。

1.3 数据处理

每组小鼠体质量以平均值±标准误差表示，用单因素方差分析法比较各组间小鼠体质量、菌群数量、肝肾中铀质量分数的差异，用sigmapolt 12.0软件对这些变量进行作图对比分析。

2 试验结果与讨论

2.1 状态及体质量变化

1)注射铀溶液后，部分小鼠死亡，存活小鼠体质量有明显下降，与空白组(生理盐水组)有极显著差异；存活小鼠出现毛发变粗糙、无光泽，尾巴颗粒状凸起，食欲不振等症状：这应是铀对小鼠肌体造成了毒害作用。继续给铀，中毒组小鼠体质量有所回升，但依然与空白组有显著差异。因此推测，如继续给铀，小鼠会逐渐对铀耐受，从而出现体质量变化不大的情况(图1)。

2)停止腹腔注射铀，中毒组与试验组体质量均有回升，而空白组在第4周基本无变化。对3组曲线走势分析，在第4周时试验组体质量逐渐偏离中毒组，而靠近空白组。表明小鼠停止铀染毒后，灌胃羧甲基壳聚糖对体质量回升更有效(图2)。

图1 第1、2周小鼠体质量变化

图2 第3、4周小鼠体质量变化

2.2 肠道菌群数量变化

1)铀染毒后的第1、2周内，小鼠体内的主要菌群(乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、大肠杆菌)与空白组均无显著差异，这与文献[10]的结论一致，推测铀损伤肌体与肠道菌群无必然联系。

2)灌胃羧甲基壳聚糖后，第3周3组小鼠的肠道菌群无显著变化；第4周试验组乳杆菌数量升高，并与其余2组形成显著差异(图3)；而双歧杆菌、肠球菌、大肠杆菌在第4周仍无显著差异(图4～6)。

图3 4周内3组小鼠肠道中乳杆菌数的变化

图4 4周内3组小鼠肠道中双歧杆菌数的变化

图5 4周内3组小鼠肠道中肠球菌数的变化

图6 4周内3组小鼠肠道中大肠杆菌数的变化

由图3看出，即使在铀染毒不利情况下，灌胃羧甲基壳聚糖仍然对小鼠肠道乳杆菌产生了促进增长作用[11]。乳杆菌是人体肠道中的正常优势菌，其代谢产物使肠道环境偏酸性，有利于宿主消化和吸收[12]；乳杆菌可以抑制病原菌，防止病原菌附着于肠上皮细胞表面，维持人体肠道微生态平衡[13]；乳杆菌还能够增加肠道中淋巴细胞数[14]，增强肌体免疫力。可以推测，羧甲基壳聚糖促进了乳杆菌的增长，从而在一定程度上使小鼠更快恢复健康。

2.3 肝肾中铀质量分数变化

4周内中毒组、试验组小鼠肾脏和肝脏中铀质量分数变化情况如图7、8所示。结果表明：

图7 4周内中毒组、试验组小鼠肾脏中铀质量分数变化

图8 4周内中毒组、试验组小鼠肝脏中铀质量分数变化

1)腹腔注射小鼠第1周，中毒组、试验组小鼠的肾脏中铀质量分数明显升高，与空白组有极显著差异，而肝脏中铀质量分数升高幅度不大，与空白组无明显差异；第2周，中毒组、试验组小鼠肾脏中铀质量分数依然与空白组有极显著差异，肝脏中铀质量分数相比第1周有所升高，与空白组形成明显差异。这说明铀在肾脏中的富集比在肝脏中的富集速度快，且富集量也多，相对于肝脏来说，肾脏是铀的主要富集器官。这与文献[15]的结论一致。

2)灌胃羧甲基壳聚糖的2周内，图7中试验组的肾脏铀质量分数呈现更快的下降趋势，但与中毒组尚未形成显著差别；图8中试验组的肝脏铀质量分数反而上升，与预期不符，有待进一步分析。

2.4 肝肾铀质量分数与体质量之间的关系

试验中发现，小鼠灌胃羧甲基壳聚糖后，肝脏中铀质量分数不降反升，且肝脏变黑且颜色较肾脏更深；但从小鼠生理状况看，该组小鼠恢复健康情况更佳：因此推测，羧甲基壳聚糖与铀形成螯合物会在小鼠肝脏中汇集，导致肝脏中铀质量分数升高；但因形成螯合物，使得铀酰离子无法再解离出来，从而对小鼠仅有低毒害作用。

基于以上推测，采取演绎推理法，从另一个角度分析试验组数据，验证试验组注射羧甲基壳聚糖2周内的体质量变化与铀在肝肾中富集量之间的关系。

以试验组4只小鼠第29天体质量减去第15天体质量作为体质量变化值，以肝肾试验组对空白组的吸光度表示铀质量分数相对值；考虑到肝脏中铀酰离子与羧甲基壳聚糖形成螯合物的假设，则肝脏中铀质量分数相对值减去肾脏中铀质量分数相对值即为螯合物相对值(见表1)。

表1 螯合物相对值与小鼠体质量的变化

以螯合物相对值为x轴，体质量变化值为y轴，绘制回归曲线，获得回归方程及相关系数，结果如图9所示。可以看出：肝脏中，螯合物相对值与体质量变化呈正相关关系(R2=0.971 6)，可认为铀酰离子与羧甲基壳聚糖在肝脏中形成了无毒性或低毒性的螯合物。

图9 小鼠体质量变化-螯合物相对值的回归曲线

3 结论

从小鼠体质量及外貌特征(皮毛等)的变化来看，铀染毒对小鼠有危害作用，出现部分个体死亡情况；小鼠肝肾中的铀有显著积累，但肠道菌群无显著变化。对铀染毒后的小鼠灌胃羧甲基壳聚糖，小鼠有恢复健康迹象，并且肾脏中铀质量分数呈下降趋势，肠道中乳杆菌数量也有所增加。可以推断，羧甲基壳聚糖对铀染毒有促排、解毒正向作用，并且可作为肠道菌群的一种益生元，促进乳杆菌增殖。

目前的铀促排化合物均不能达到理想效果，因此根据与铀的配合能力强、毒副作用小、生物相容性好、天然等特点，研究壳聚糖衍生物——羧甲基壳聚糖，进一步提高其水溶性、对铀的吸附能力，可为铀促排剂的研发提供新材料，也为开发益生元及寻找新的生物活性物质提供理论依据。

对含铀废水的处理、铀的体外吸附等问题已有研究，壳聚糖及其衍生物对肠道菌群的影响近年来也有许多研究，但机体铀中毒后，水溶性壳聚糖对铀的解毒效果、肠道菌群的影响尚未见有报道。寻找一种生物相容性好、吸附性能好、毒副作用低的铀促排剂，同时将水溶性壳聚糖开发为益生元，加入到食品中，具有重要意义。