肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶检测方法的研究进展*

孙铭艳 吴倩倩 陶元勇

肺炎克雷伯菌是医院感染的重要病原菌，可引起身体各部位感染[1]。临床医生曾将碳青霉烯类药物作为治疗耐药肺炎克雷伯菌感染的最后一道防线，但由于抗菌药物的不规范使用，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CR-KP)不断增多[2]。2008年，印度携带新德里金属-β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-βlactamase-1，NDM-1)耐药基因的“超级细菌”的报道引发全球广泛关注[3]。我国耐药形势同样不容乐观，2017年中国细菌耐药监测数据显示，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物亚胺培南和美罗培南的耐药率均已超20%[4]。耐药菌的出现增加了患者负担，给临床治疗带来极大困难。

CR-KP的耐药机制包括产碳青霉烯酶、高产AmpCβ-内酰胺酶(AmpC酶)、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)合并膜孔蛋白缺失及外排泵的过度表达，产碳青霉烯酶是其最主要的耐药机制[5]。碳青霉烯酶包括A类酶、B类酶和D类酶，不同种类的碳青霉烯治疗方案不同，准确和快速地检测碳青霉烯酶并加以正确的临床治疗可减缓细菌耐药的产生。为此，系统综述碳青霉烯酶实验室检测方法，为碳青霉烯酶的检测提供依据。

1 碳青霉烯酶表型检测方法

实验室常规工作中，可通过纸片扩散法(K-B法)或稀释法(MIC法)检测细菌对碳青霉烯类药物的敏感性初步筛查碳青霉烯酶[6]。但该方法容易造成漏检，需借助其他检测方法进行确认。表型检测方法简单、易于观察，包括培养基筛查、改良霍奇试验(modified Hodge test，MHT)、Carba NP试验、碳青霉烯灭活试验(carbapenem inactivation method，CIM)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)。

1.1 培养基筛查

显色培养基利用细菌产生的碳青霉烯酶使培养基的显色剂发生颜色变化来进行判断。ChromID ESBLs培养基最早用于ESBLs的检测，随后用于检测碳青霉烯酶，可有效检测碳青霉烯酶的A类酶和B类酶，对D类酶的筛查作用较小[7]。科马嘉KPC显色培养基能快速筛查出产碳青霉烯酶菌株，但无法通过显色反应区分碳青霉烯酶的A类酶和B类酶。Hornsey等[8]在进行显色培养基比对时发现，当菌落数＞106CFU/ml时，该培养基也能有效筛查产D类酶的肺炎克雷伯菌。SUPERCARBA培养基是2012年Nordmann等[9]研发的一种非显色培养基，该培养基对常见碳青霉烯酶的检测能力明显改善，能检测A类、B类和D类碳青霉烯酶。

除SUPERCARBA培养基外，其他培养基不能有效检测D类碳青霉烯酶。此外筛查的阳性菌株还需通过分子技术进行确认，增加了时间与经济成本，使用上受到一定限制[10]。

1.2 改良霍奇试验(MHT)

MHT可用于检测A类、B类和D类碳青霉烯酶[11]。操作简单，结果易于观察，常规实验室即可开展，见图1。

图1 改良霍奇试验(MHT)

图1显示，受试菌产生碳青霉烯酶，使扩散到培养基中的厄他培南失活。因此C处无足够量厄他培南抑制大肠埃希菌ATCC25922生长，出现抑菌圈凹进现象。但MHT在检测产ESBLs或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失的菌株时易出现假阳性结果，检测产NDM型金属酶时可出现假阴性结果。2018年，美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)已将MHT从抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI M100)中删除。

1.3 Carba NP试验

Carba NP试验方法于2012年由Patrice Nordmann研究团队首次报道[12]。2015年CLSI新增Carba NP试验用于检测碳青霉烯酶。该方法利用酚红作为指示剂，采用比色法，检测常见碳青霉烯酶耐药表型的特异性及灵敏度均大于90%[13]。Carba NP阳性菌株无需修改碳青霉烯类药物的药敏试验结果，主要用于院感监测及流行病学调查。目前没有推荐此试验作为常规试验。其不足之处在于：①需要特殊试剂；②某些检测结果无效；③无法区分碳青霉烯酶型别等。

1.4 碳青霉烯灭活试验(CIM)

CIM于2015年由荷兰van der Zwaluw研究团队首次报道，可在较短时间内检测碳青霉烯酶，且对常见碳青霉烯酶的耐药表型与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测结果具有高度一致性，特异度为95.5%，灵敏度为95.7%[14]。2017年CLSI引入改良CIM(modified carbapenem inactivation method，mCIM)用于检测肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的表型确认，其与CIM的不同之处在于菌悬液所用的实验室用水由胰蛋白酶大豆肉汤取代，加入美罗培南药敏纸片后，孵育时间也从2 h延长至4 h。操作方法见图2。

图2 改良碳青霉烯(mCIM)的灭活方法及操作方法

mCIM减少了ESBL或AmpC所致的假阳性结果，对非产碳青霉烯酶的耐碳青霉烯类抗菌药物肠杆菌科细菌识别能力更强，对D类酶敏感性较高。但不足之处在于其不能区分碳青霉烯酶的耐药型别。为弥补这一不足，2018年CLSI引入EDTA改良碳青霉烯灭活试验(EDTA-carbapenem inactivation method，eCIM)，通过加入乙二胺四乙酸(EDTA)抑制金属酶活性，与mCIM试验联合，用以判断产酶情况及区分金属酶和丝氨酸酶[16]。CIM试验操作简便、成本低且结果易于判断，对A类酶、B类酶和D类酶的敏感性高。但试验孵育耗时长，不能实现快速检测的目的，因此尚未在临床微生物实验室常规开展[17]。

1.5 MALDI-TOF MS检测

MALDI-TOF MS是一种新型软电离生物质谱，其原理是离子在电场作用下加速通过飞行通道，根据到达检测器的飞行时间不同，即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比来对离子进行检测，具有检测速度快、灵敏度高和易于自动化等优点。MALDI-TOF MS的快速检测对于急性病例和特殊病原体的及时、准确鉴定及细菌耐药检测方面的应用具有较好发展前景[18]。目前，MALDI-TOF MS已被用于产碳青霉烯酶菌株的检测，具体方法为：将含有碳青霉烯类药物的缓冲液与过夜培养的检测菌共同孵育4 h后，离心取上清进行检测。通过对比碳青霉烯类药物与其降解产物质谱峰值的变化来判断有无碳青霉烯酶产生，但无法区分碳青霉烯酶型别。MALDI-TOF MS对细菌耐药的检测有助于临床抗感染治疗，缺点为仪器昂贵，常规实验室难开展[19]。

2 分子技术

已有的表型检测方法不能完全区分碳青霉烯酶型别，且检测结果需用分子技术进行验证。传统PCR通量低、耗时长、实验操作繁琐及产物易污染等缺点制约了其在实验室的应用。近年来，开发一系列新型分子技术用以检测碳青霉烯酶，包括实时荧光定量PCR、多重PCR、环介导等温扩增法、基因芯片和二代测序(next-generation sequencing，NGS)。

2.1 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR将荧光染料或荧光探针加入到PCR反应体系中，通过将实时监测到的荧光信号与校准品进行比较，得出相应检测结果。Higuchi等于1993年最早提出该方法，美国Perkin Elmer公司于1995年成功研发该新技术[20]。实时荧光定量PCR克服传统PCR的诸多不足，且检测结果与传统PCR具有较高一致性。此外，该方法的检测下限较低，可直接用于临床标本的产碳青霉烯酶菌株耐药基因的定性及定量检测[21]。

2.2 多重PCR

多重PCR是将多对特异性引物同时加入到一个反应体系中，循环条件满足所有引物，目的基因扩增后存在易分辨和识别的差异，可实现在一个反应中同时检测多个目的基因。Monteiro等[22]首次报道使用实时多重PCR的方法，通过一个单独的反应进行熔化曲线分析，在3 h内快速并准确的完成碳青霉烯酶耐药基因，即NDM、KPC、GES、IMP、VIM和OXA-48的分析，方法的另敏度与特异度均为100%。其还可用于临床标本耐药基因的直接筛查。多重PCR具有高通量、高效率的优势，但需配备专业的技术人员与设备。

2.3 环介导等温扩增法

环介导等温扩增法是由Notomi等[23]研发的一种新型核酸扩增技术。针对目的基因的6个特异性序列设计2对引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，1 h可将目的基因扩增109～1010倍，整个反应在等温条件60～65 ℃下进行，实现了特异和高效扩增，并可通过肉眼观察反应副产物焦磷酸镁沉淀判断结果。与多重PCR不同的是，该方法可改变其条件及引物检测新的基因，在某些反应中对新基因及靶位的检测敏感性高，还可用于检测临床标本的碳青霉烯酶耐药基因[24-25]。

2.4 基因芯片

基因芯片是一种通过与已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的分子技术。此技术易于商品化，在微生物鉴定及耐药检测领域得到良好应用。Braun等[26]用基因芯片对117株包括肠杆菌科细菌在内的临床分离菌进行菌株鉴定及碳青霉烯酶等耐药基因的检测，检测灵敏度为98.2%，特异度为97.4%。

2.5 二代测序(NGS)

NGS是生物医学领域的一项重要变革，目前已被广泛用于疾病筛查及诊断、微生物鉴定、耐药基因检测及药物研发等医学领域[27-28]。其原理是在每一个测序周期中，利用计算机检测DNA聚合酶催化荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸结合到DNA模板时产生的荧光信号来确定DNA序列，实现了边合成边测序。在碳青霉烯酶耐药基因检测方面，既可对常规培养菌株进行检测，也可直接对临床标本进行检测，有效缩短检测时间[29]。此外，NGS不仅能检测已知的碳青霉烯酶耐药基因，还能明确由非产酶原因即膜孔蛋白的缺失和外排泵的过度表达导致的碳青霉烯类药物耐药[30]。

3 展望

抗菌药物的不合理使用使细菌的耐药形势尤其是碳青霉烯类药物的耐药形势日趋严峻。针对耐药菌，在有效的新型抗菌药物上市前及时并准确地检测，对感染的有效治疗及耐药菌的传播尤为重要。

在肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型检测方法中，各项试验原理一致，均利用碳青霉烯酶水解碳青霉烯类药物的活性进行设计，其特异性高，但对于低表达或水解活性低的碳青霉烯酶检测的敏感性差。目前，CLSI推荐Carba NP试验和CIM试验用于碳青霉烯酶表型检测。利用分子技术检测碳青霉烯酶均为耐药基因的直接检测，不仅能检测碳青霉烯酶，还能进行酶的分型。而NGS在此基础上所获信息更全面，还能检测未知的耐药基因。随着技术发展及成本的下降，NGS将有广阔的发展前景。