microRNAs与角膜新生血管

张晓萍，王 琛，狄国虎

0 引言

角膜的透明性对于维持眼睛正常屈光非常重要，某些病理条件下，如先天性疾病、炎症、化学烧伤、角膜缘干细胞缺乏、感染性角膜炎、自身免疫性疾病以及角膜移植排斥反应等，促血管和抑制血管因素之间的平衡被打破，引起血管内皮细胞增殖并迁移到角膜基质，发生角膜新生血管引起视力下降甚至致盲[1]。角膜疾病是重要的致盲原因，每年有约1400万角膜新生血管患者需要治疗[2]。

正常角膜处于富含血管的环境中，却能保持无血管化，归因于内源性血管抑制因子。microRNAs(miRs)是一类内源性小分子非编码RNA，长度约22个核苷酸。1993年最先在秀丽隐干线虫中发现miRs[3]，随后关于miRs的研究迅速发展，miRs几乎存在于所有多细胞动物和植物，其表达具有组织特异性，且随着发育进程也发生变化。miRs在人体中分布广泛，具有重要的生物学功能，近年研究发现，某些miRs在角膜新生血管的形成中发挥重要的调控作用[4-6]。

1 miRs在角膜的表达

角膜上皮细胞层对于预防角膜感染、维持角膜正常功能发挥重要作用[7]，角膜中特异性表达的miRs有助于维持角膜无血管化。Ryan等[8]对成年小鼠的角膜上皮、晶状体、睫状体和视网膜进行微阵列分析，发现miRs在眼部各结构中的表达并不相同，超过31种miRs在角膜中高表达。同一种miR在角膜各层的分布也不完全一致，如miR-184主要表达于角膜基底上皮层，而表层上皮层很少表达，在角膜缘及结膜上皮层不表达[8-9]，miR-205和miR-217在全角膜、角膜缘及结膜上皮中均有表达，miR-182在角膜上皮及角膜缘上皮中低表达[8]。在生理和病理情况下，同一部位的miRs表达发生变化，在正常角膜中miR-204主要高表达于上皮层，发生角膜新生血管后，角膜上皮中miR-204降低，而角膜基质的miR-204表达并无明显变化[10-11]，这些差异表达的miRs对角膜新生血管具有重要的调控作用。角膜中有丰富的神经分布，正常的神经支配对于维持角膜上皮层的完整性非常重要，在糖尿病性角膜病变中，角膜敏感性和神经分布异常，角膜损伤后修复时间延长，体外研究发现miR-182能够促进糖尿病鼠的三叉神经元生长，外源性增强miR-182表达有助于小鼠角膜上皮修复[7]。另有研究发现miR-183/96/182在角膜和三叉神经节中表达，抑制miR-183/96/182表达使角膜神经密度降低，此外，miR-183/96/182通过调控角膜神经支配和固有免疫而参与绿脓杆菌性角膜炎的病理过程[12]。

2 miRs参与调控免疫和炎症反应

角膜化学损伤是引起角膜新生血管的常见原因，急性期内各种细胞因子高度聚集，小鼠角膜碱损伤后6～72h内角膜水肿逐渐加重，角膜中miR-206表达明显升高，miR-206直接靶向调控连接蛋白43(Cx43)的表达，Cx43广泛分布于哺乳动物的各个组织器官中，与角膜损伤引起的炎症损伤关系密切，Cx43在角膜损伤后24h～3wk，先低表达再高表达，到损伤3wk时再次低表达，Cx43表达增高有助于抑制炎症反应、促进角膜损伤修复[13-15]。在碱烧伤后72h内抑制miR-206表达有助于抑制角膜炎症反应，减轻碱烧伤引起的角膜损伤[15]。在大鼠角膜碱烧伤过程中，骨髓间充质干细胞中高表达的miR-146a有助于抑制细胞凋亡，由于miR-146a降低p65核因子-κB(p65 NF-κB)和增殖细胞核抗原的表达、减少炎症因子分泌，进而抑制大鼠角膜碱烧伤引起的角膜新生血管形成[16]。

单纯疱疹病毒(HSV)感染引起角膜慢性免疫炎症反应，反复发作后引起角膜新生血管生长、炎症细胞浸润。近期研究发现，病毒编码的miRs参与肿瘤发生[17]，人巨细胞病毒与细胞miRs协同发挥作用，使病毒免受免疫系统清除，获得免疫逃逸[18]。角膜病毒感染引起某些miRs改变，如角膜HSV感染2d时，miR-132明显升高，miR-132靶向调控血管相关因子Ras1的活性，进而发挥抑制角膜新生血管的作用[19]。研究发现，HSV1感染可引起角膜高表达miR-155，这种高表达主要出现在巨噬细胞和CD4+T细胞中，少量出现在中性粒细胞，小鼠敲除miR-155后，眼部及淋巴器官的Th1和Th17被抑制，淋巴结中活化CD4+T细胞的磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸肌醇5-磷酸酶1和IL-γ受体a链水平增高，这有助于减轻病毒性角膜炎的基质损伤，而抑制miR-155表达可使HSV1感染引起的角膜基质炎减轻，并且角膜新生血管也减少，表明miR-155参与基质性角膜炎的病理过程[20]。现已证实，一些促炎症相关的miRs，如miR-155、miR-132、miR-223等也参与基质性角膜炎的病理过程，且与角膜新生血管形成有关[21]。

真菌性角膜炎是常见的角膜感染类型，角膜溃疡发生过程中往往伴有严重的炎症反应，糖皮质激素虽然能很好地抑制炎症反应，但是会加重真菌感染，与正常角膜相比，真菌感染的角膜中miR-204、miR-184、miR-511-5p、miR-142-3p、miR-155-5p、miR-451a等表达明显下降，其中miR-451a可通过靶向调控巨噬细胞迁移抑制因子而影响细胞凋亡、炎症、细胞增殖及损伤修复[22]。

在角膜新生血管的形成过程中，角膜新生淋巴管经常与新生血管同时出现，尤其在角膜移植后排斥反应中[23]。Grimaldo等[24]对miR-184与角膜淋巴管的关系进行了研究，发现角膜炎症性淋巴管中miR-184表达降低，提示miR-184可能作为天然的角膜淋巴管抑制剂而发挥作用；通过结膜下注射miR-184模拟物增强其表达后，淋巴管的侵袭面积明显减少；进一步以miR-184模拟物转染人淋巴管内皮细胞后，细胞的迁移、成管性都明显下降；因此证实miR-184与角膜淋巴管密切相关。由于角膜中淋巴管增多引起巨噬细胞浸润，巨噬细胞作为血管内皮生长因子(VEGF)的重要来源[25-26]，容易诱发新生血管形成，因此抑制角膜淋巴管也有助于减轻角膜新生血管[27]。

角膜受到病毒感染、真菌感染、化学伤等损伤后，往往伴有明显的炎症因子和免疫细胞浸润，同时多种miRs的表达发生变化，在某些有糖皮质激素使用禁忌的角膜炎症中，外源性改变miRs的表达可靶向调控参与炎症反应、免疫细胞分化、宿主免疫过程的细胞因子和蛋白质表达，抑制角膜炎症反应，阻止角膜新生血管的发生[22]。

3 miRs参与调控促血管生成因子的表达

生理情况下，促血管生成因素和抑制血管生成因素保持平衡，使角膜透明、无血管化。常见的促血管生成介质有VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、基质金属蛋白酶(MMP)等，其中VEGF-A是最重要的促血管生成因子，其与VEGFR1/R2结合后发挥促血管形成作用。角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞均可产生VEGF，当角膜发生新生血管、炎症和瘢痕时，VEGF表达上调。近年研究发现某些miRs可通过调控VEGF的表达参与角膜新生血管形成。

miR-21是let-7家族的成员之一，在内皮细胞中高表达。年轻人内皮祖细胞中miR-21和miR-10A高表达，两者抑制高迁移率族蛋白A2(Hmga2)表达，引起内皮祖细胞衰老，而且内皮祖细胞的血管生成能力也降低；而老年人内皮祖细胞miR-21和miR-10A表达低，Hmga2水平升高，使内皮祖细胞更富活力，细胞的血管形成能力提高[28]。人支气管上皮细胞经过亚砷酸盐处理后miR-21表达升高，引起VEGF高表达，最终促进新生血管形成[29]。与之不同的是，在角膜新生血管的发生过程中，miR-21能抑制VEGF的表达，发挥抑制新生血管的作用。研究发现，碱烧伤后角膜新生血管开始生长的同时，miR-21、VEGF-A和缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)明显增高，miR-21抑制剂能完全抑制p-ERK活性，消除HIF-1α聚集，降低VEGF-A表达，抑制角膜新生血管的面积和血管数量[30]。

由于VEGF可促使miR-296表达，后者靶向肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate，HGS)，使VEGFR2和血小板源性生长因子β(PDGF-β)受体水平升高，提高其对VEGF的反应性。将人原代脑微血管内皮细胞与神经胶质瘤细胞共培养或用血管生长因子刺激，在促进细胞成管的同时，miR-296表达水平升高，故抑制miR-296的表达能抑制血管生成，高表达则起相反的作用[31]。研究发现，miR-296不仅调控肿瘤新生血管生长，也参与角膜新生血管的形成。小鼠碱烧伤诱导角膜新生血管模型中，局部进行左氧氟沙星加FK506或左氧氟沙星加地塞米松处理对角膜新生血管均有明显的抑制作用，而且miR-296表达明显下降的同时，伴有FGF23蛋白水平降低，说明miR-296是调控角膜新生血管形成的重要因素[32]。

在经典的缝线诱导角膜新生血管模型中，缝线周围角膜水肿、炎症细胞浸润，引起VEGF高表达，miR-184能降低VEGF和β-catenin表达水平，抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和人角膜上皮细胞的增殖、迁移以及抑制RF/6A细胞的成管性能，因而高表达miR-184使角膜新生血管面积减少[33]。PDGF-β、FOG2(friend of Gata 2)和磷脂酸磷酸酶2b(PPAP2B)都是促血管生成因子，FOG2调节VEGF表达，而PDGF-β调节Akt活性。miR-184直接靶向抑制FOG2、PDGF-β及PPAP2B，通过降低VEGF表达和抑制Akt信号通路而发挥抑制角膜新生血管的作用。miR-184高表达能抑制细胞MMP2表达水平，敲除miR-184使MMP2水平升高。由于MMP2是Akt信号通路的下游因子，并由Akt直接调控，故认为miR-184具有抑制促进血管生成因子Akt活性的作用[9]。

在碱烧伤以及缝线诱导小鼠角膜新生血管模型中，miR-204表达下降，随着角膜新生血管的消退，miR-204表达又有回升，通过角膜基质注射或结膜下注射方法增强miR-204的作用后，角膜VEGF-A和血管生成素1表达明显降低，因此新生血管明显减少[10，34]。

目前治疗角膜新生血管的药物和方法较多，其中抗VEGF药物在某些视网膜新生血管性疾病中取得了一定疗效，有学者提出使用抗VEGF药物治疗角膜新生血管。但是，动物实验研究发现，贝伐单抗可损害角膜神经，结膜下注射贝伐单抗使角膜敏感性下降、角膜损伤后修复时间延迟[35]。另外，不同类型的角膜新生血管对抗VEGF药物的敏感性并不一致，新发生的血管存在动态的病理过程，抗VEGF药物效果较明显，而静止的成熟血管对抗VEGF药物并不敏感，而且抗VEGF药物对深层血管的疗效也不明显[36]。越来越多的研究证实，miRs在角膜新生血管的形成中发挥重要的作用，这为寻找治疗角膜新生血管的新策略提供了依据。

4 miRs在基因敲除鼠中的作用

由于KLEIP(Kelch-like Ect 2-interacting protein)对于角膜结构和透明性非常重要，KLEIP-/-小鼠可自发角膜营养不良和角膜新生血管[37]。Kather等[38]研究发现，KLEIP-/-小鼠发生角膜营养不良的早期，血管和淋巴管自角膜缘发出，晚期血管长至角膜中央，多数血管位于上皮下，几乎没有血管位于基质中，新生血管的生长方向提示在角膜上皮中存在引导血管生长的因素。在KLEIP-/-小鼠角膜营养不良晚期，经典的血管生长因子VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和FGF2均无明显上调，但是在从2期进展到3期的过程中，血管生成素-1及其受体Tie2均明显增高。以miR-204-5p模拟物转染血管内皮细胞后，血管紧张素-1蛋白水平明显下降，表明miR-204可通过调控血管紧张素-1引起KLEIP-/-小鼠角膜营养不良、角膜新生血管形成。

5 其它

目前治疗角膜新生血管的药物较多，部分药物可通过调控某些miRs表达发挥抑制角膜新生血管的作用。姜黄素对大鼠碱烧伤角膜新生血管具有抑制作用[39]，进一步研究发现姜黄素引起HUVEC细胞高表达miR-1275和miR-1246，外源性改变miR-1275和miR-1246的表达，可引起与新生血管相关的VEGF-B和NF-κB表达变化[40]。舒尼替丁和贝伐单抗是常用的抗VEGF药物，分别局部使用舒尼替丁和贝伐单抗治疗大鼠角膜新生血管后，VEGF-A和VEGFR2降低，同时miR-15b、miR-16、miR-126表达降低，而miR-210表达增高，提示舒尼替丁和贝伐单抗可能通过调控miRs的表达发挥抑制新生血管的作用[41]。

6 miRs在角膜新生血管中的研究前景

角膜内源性miRs在维持角膜无血管化中发挥极其重要的作用，但由于角膜新生血管形成过程复杂，尚需更多研究证实miRs的调控作用。miRs之间能相互影响，一种miR可通过调节另一种miR的表达而发挥作用[42]，目前以单一miR在角膜新生血管中的研究居多，在角膜新生血管形成过程中，多个miRs之间是否有协同作用仍有待于进一步研究。此外，角膜miRs模拟物和拮抗剂能靶向增强或抑制miRs的作用，有望成为治疗角膜新生血管性疾病的新方法。