miR-10a在非酒精性脂肪性肝病大鼠中的表达及作用机制

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外乙醇和其他明确的肝损伤因素所致的，以肝脏细胞脂肪变性和肝脏细胞内脂肪过度沉积为特征的临床病理综合征[1]。随着人们生活水平的提高，生活方式和饮食习惯发生了很大改变，NAFLD的发病率目前呈逐年上升趋势，且患者越来越趋于年轻化，给人们的身体健康带来了巨大的威胁，也给个人、家庭和社会带来了很大的经济负担，但其发病机制尚未完全清楚。近年来研究发现，微RNA(miRNA)在NAFLD的发生、发展中具有非常重要的作用[2]。miRNA是长为21～23个核苷酸序列的单链非编码RNA，且是一种重要的基因转录后调控因子，可以调控人类超过30%的基因，对细胞分化、增殖、代谢和凋亡等过程具有重要作用。miRNA在慢性病毒性肝炎和肝细胞癌中具有调控作用[3]。miR-10a主要在肝脏、肾脏和肺组织中表达，研究发现沉默miR-10a可调控组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)表达[4]。HDAC3表达升高对脂毒性肝损伤具有抑制作用[5]。沉默miR-10a能否通过过表达HDAC3对NAFLD起到缓解作用仍有待考察。本研究观察并探讨了沉默miR-10a对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝脏脂代谢的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48只雄性SD大鼠，体质量为180～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，置于SPF级实验室中(恒温，恒湿，每日12 h光照)。实验动物自由进食、饮水，适应性饲养1周后进行后续实验。

1.2 主要试剂与仪器

试剂：胆固醇(批号20170902)、胆酸钠(批号20170806)、果糖(批号20170903)均购自武汉科瑞生物技术有限公司，食盐购自索特盐化股份有限公司，总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒均购自美国Invitrogen公司，三酰甘油(TG)检测试剂盒、总胆固醇(TC)检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，HDAC3 沉默信息调节因子1(SIRT1)多克隆抗体购自美国Millipore公司，si-miR-10a腺病毒及空载腺病毒由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司提供。仪器：酶标仪、PCR仪、稳压稳流电泳仪由美国Bio-RAD公司提供，台式高速离心机由美国Thermo Scientific公司提供。

1.3 造模方法

本实验采用饲喂高脂饲料的方法构建NAFLD大鼠模型[6]，高脂饲料：基础饲料53 %、胆固醇5 %、猪油20 %、胆酸钠0.25 %、果糖20 %和食盐1 %。选取48只大鼠，根据体质量随机分为2组，空白组12只，给予普通饲料；模型组36只，给予高脂饲料。8周后，模型组随机选取6只大鼠，空白组随机选择2只大鼠进行肝脏组织病理学检查，判断造模是否成功。成模标准以肝脏组织发生明显水肿，胞浆出现大量脂滴，呈肝细胞脂肪变性，偶见肝细胞点状坏死或者炎性反应等现象，判定为造模成功。将造模成功的30只大鼠随机分为模型组(B组)、Ad-ctrl组(C组)和Ad-si-miR-10a组(D组)，每组10只。C组尾静脉注射腺病毒载体作为对照，D组尾静脉注射si-miR-10a腺病毒，连续注射2周，期间继续给予高脂饲料。将空白组剩余的10只大鼠设为A组，继续饲喂普通饲料。

1.4 标本采集

按照上述方法喂养10周后，大鼠于处死前禁食一夜，次日称重，乙醚麻醉，下腔静脉取血，摘取肝脏组织称重，计算肝脏指数，肝脏指数=肝脏质量(g)/体质量(g)100%。取部分肝脏组织置于4 %的多聚甲醛中固定48 h，剩余部分保存于-80 ℃的冰箱中。

1.5 ELISA法检测肝脏组织中TG、TC、LDL-C表达水平

肝脏组织中加入适量的裂解液，应用组织研磨机研磨肝脏组织，将研磨后的组织液匀浆在4 ℃环境下，3 000 r/min离心15 min，取上清，按照试剂盒说明书测定TG、TC、LDL-C表达水平。

1.6 油红O染色观察肝脏组织的病理学改变

将肝脏组织用4 %的多聚甲醛固定，固定后的肝脏组织经石蜡包埋，切成4 μm厚的切片，随后进行脱蜡和水化，然后进行油红O染色[7]。

1.7 Real-time PCR法检测miR-10a和HDAC3 mRNA水平

应用Trizol提取肝脏组织总RNA，将RNA反转录成cDNA，根据试剂盒说明书在PCR仪上完成检测过程，以GAPDH为内参，对肝组织miR-10a和HDAC3的mRNA水平进行相对定量[8]。反应条件：95 ℃ 10 min，随后进行40 次循环，每次循环95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s。采用2-ΔΔCt法计算结果。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot法检测HDAC3蛋白水平

肝脏组织中加入适量的RIPA裂解液，提取总蛋白并定量，SDS-PAGE 120 V电压电泳100 min，200 mA转膜90 min，脱脂牛奶室温封闭1 h，HDAC3抗体(1∶1000)4 ℃孵育过夜，PBST洗3遍，每次10 min，二抗(1∶4000)室温孵育1 h，PBST洗3遍，每次10 min，曝光显影，采用ImageJ软件进行光密度分析[9]。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、肝脏指数的比较

4组大鼠的体质量、肝脏指数比较，差异均具有统计学意义(F=4.00、8.50，P<0.001)。与A组相比，B组、C组、D组体质量显著升高(P<0.05), B组和C组的肝脏指数显著升高(P<0.01)。与B组相比，C组的体质量及肝脏指数、D组的体质量无显著变化(P>0.05)，而D组的肝脏指数显著降低(P<0.05)。与C组相比，D组的体质量无显著变化(P>0.05)，而D组的肝脏指数显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠体质量、肝脏指数比较()

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

2.2 各组大鼠肝脏TG、TC、LDL-C表达水平比较

各组大鼠TG、TC、LDL-C的表达水平组间比较，差异均具有统计学意义(P<0.001)。与A组相比，B、C组的TG、TC、LDL-C水平显著升高(P<0.05)。与B组相比，C组TG、TC、LDL-C水平无显著变化(P>0.05)，D组TG、TC、LDL-C水平显著降低(P<0.05)。与C组相比，D组TG、TC、LDL-C含量显著降低(P<0.05)。见表3。

2.3 各组大鼠肝脏组织油红O染色结果

由图1可知，A组大鼠肝脏细胞排列紧密，脂滴数量较少；B、C组大鼠肝脏细胞肿胀，脂滴沉积加重，细胞排列不规则，细胞质中有空泡；D组大鼠肝脏细胞排列较为致密，脂滴沉积程度较C组明显减轻，空泡化程度有所改善。

表3 各组大鼠肝脏TG、TC、LDL-C水平比较()

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

图1 各组肝脏组织病理图片 油红O染色 ×400 A 空白组 B 模型组 C Ad-ctrl组 D Ad-si-miR-10a组

2.4 各组大鼠肝脏组织miR-10a、HDAC3 mRNA水平比较

各组大鼠miR-10a、HDAC3 mRNA水平组间比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)。与A组相比，B组、C组miR-10a mRNA的表达水平显著升高，HDAC3 mRNA的表达水平显著降低(P<0.01)，而D组miR-10a、HDAC3 mRNA的表达水平无显著变化(P>0.05)。与B、C组相比，D组miR-10a的表达水平显著降低，HDAC3 mRNA显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠肝脏组织miR-10a、HDAC3 mRNA

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

2.5 各组大鼠肝脏组织HDAC3蛋白表达水平的比较

A、B、C、D组大鼠的HDAC3蛋白相对表达量为1.11±0.15、0.63±0.18、0.59±0.24和0.98±0.11，组间比较差异均具有统计学意义(F=18.07、9.65、9.20，P均<0.001)。与A组相比，B组、C组HDAC3蛋白的相对表达量显著降低(P<0.05)。与B、C组相比，D组HDAC3蛋白的相对表达量显著升高(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠肝脏组织HDAC3蛋白的电泳图

3 讨论

近年来NAFLD的发病率逐渐升高，在西方国家的发病率为20%～50%，且患者逐渐趋于年轻化，在肥胖人群中其发病率高达75%[10-11]。目前NAFLD的发病机制普遍认同的是“二次打击”学说[12]，但该学说并不能完全阐明NAFLD的发病机制。

肝脏是体内重要的代谢器官，肝脏的代谢功能受肝脏细胞内HDAC3的调控，而miR-10a对HDAC3有很好的调控作用[4-5]。为了研究miR-10a与NAFLD患者肝脏脂肪变性的关系，本研究通过高脂饮食的方法构建了大鼠的NAFLD模型，发现造模成功后大鼠肝脏组织的肝脏指数、TG、TC、LDL-C水平显著升高，肝脏组织中可以看到明显的脂滴沉积，表明NAFLD模型构建成功。为了进一步验证肝脏脂肪变性是由miR-10a的过表达所造成的，本研究通过给饲喂高脂饲料的大鼠尾静脉注射si-miR-10a腺病毒，结果表明在NAFLD中miR-10a的低表达可以使肝脏组织的肝脏指数、TG、TC、LDL-C水平显著降低，可以改善肝脏组织脂质沉积现象，提示miR-10a参与了脂肪的沉积，抑制miR-10a的表达可以明显改善肝脏组织脂滴沉积现象。有研究表明，HDAC3与肝损伤密切相关[13]。HDAC3可参与多种组织细胞的能量代谢过程，有研究表明HDAC3可激活脂肪酸合成及氧化循环，调节白色脂肪组织代谢[14]。此外有研究证实，在异烟肼诱导的肝细胞氧化应激损伤中，HDAC3表达失衡，促进了炎性细胞因子大量分泌，加速肝细胞损伤[15]。本研究发现，NAFLD大鼠中HDAC3 mRNA和蛋白的表达水平均显著降低；在抑制miR-10a的表达后，HDAC3 mRNA和蛋白的表达显著升高。结果提示，miR-10a沉默可通过调节HDAC3改善高脂饮食诱导的肝脏细胞脂滴沉积，为治疗NAFLD提供了新的思路。