梅花鹿鹿油的提取及成分检测

杨富雅，赵丽华，孙尧，吕偲丞，高冷，*

（1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012；2.长春金荷药业有限公司，吉林长春130012）

梅花鹿（Cervus nippon）是一种珍贵的、具有药用价值的特种动物，随着我国鹿业市场的逐步成熟，市场对鹿茸、鹿胎等产品需求量的增加[1]，特别是随着市场对鹿产品需求量的提高，在生产过程中，产生了大量的与梅花鹿相关的生产废物，其中主要为鹿脂肪中的油脂，也就是鹿油。经相关报道，鹿油易被皮肤吸收，不仅能够保湿锁水、滋养肌肤，还具有抗氧化的作用，可以延缓皮肤衰老、预防皮肤疾病，此外对动脉硬化及老年性肥胖症的预防也是有帮助的，因此广泛应用于食品[2]、保健品及化妆品[3]等领域。目前，我国对鹿油研究较少，对鹿油成分分析鲜有相关报道。

CO2是一种无毒、纯度高、可再循环利用的溶剂，是超临界流体提取技术最常用的溶剂[4-5]。与常见的有机溶剂提取法相比，超临界流体提取物中没有溶剂残留，同时CO2的临界压力与临界温度较为温和，提取过程可以在较低的压力温度下进行，不会对热敏性物质产生影响，更不会引起部分物质的氧化[6]。作为一种环境友好型技术，超临界流体提取被应用于各种科学和工业生产领域[7]。张承红等[8]研究了超临界二氧化碳萃取牛尾独活挥发油的工艺条件，探究了不同提取条件对牛尾挥发油提取率的影响。由于气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用的灵敏度较高、抗干扰能力强，在化学、生物领域具有广泛的应用。杨君[9]主要通过GC-MS 分析法检测植物油中多环芳烃的含量，优化了检测的工艺条件。并且研究经过脱酸、脱色和脱臭加工工序后多环芳烃的含量变化情况。现阶段，运用此方法检测动物油脂主要成分的研究相对较少。

本研究考察了不同的提取因素对鹿油提取率的影响。以单因素试验为基础，进行正交试验设计，研究各因素之间的交互作用，特别是提取温度与提取压力对超临界流体溶解度和传质系数的交互影响。此外对超临界CO2提取鹿油进行极差分析，利用极差分析确定不同因素对鹿油提取率的影响强弱，对提取工艺进行优化。通过GC-MS 对鹿油的成分进行检测，鉴定其主要成分，为更好的开发并应用鹿油创造了条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

梅花鹿鹿肉脂肪：吉林省双阳区鹿乡镇。

1.1.2 试验试剂

CO2钢瓶（40L）：沈阳鑫东基化工气体有限公司；正己烷（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；氢氧化钠、甲醇、乙醚、氢氧化钾、氯化钠（分析纯）：北京化工厂。

1.1.3 试验仪器设备

气质联用仪（SCION SQ）：上海冉超光电科技有限公司；超临界CO2提取仪（HA221-50-06）：江苏华安科技有限公司；真空干燥箱（DZ-2AII）：南京诺泰施格科学仪器有限公司；超声波清洗器（SCIENTZ-HF2000）：宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平（HX2002T）：慈溪市天东衡器厂。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理

将新鲜鹿脂肪除杂破碎放至超声波清洗仪（40 kHz，30 ℃下超声清洗30 min）中清洗，再进行真空干燥，相对真空度0.09 MPa，温度90 ℃干燥至表面不含水分，放置备用。

1.2.2 工艺流程与操作流程

鹿脂肪→除杂破碎→超声清洗→干燥脱水→装料→超临界CO2提取→鹿油

称取500.00 g 经过预处理的鹿脂肪原料装入萃取釜中，加盖拧紧，装入反应容器中，升温，加压，调节CO2流量，提取一定时间后收集鹿油。

鹿油提取率公式：

式中：X 为鹿油的提取率，%；m1为提取出鹿油的质量，g；m2为鹿脂肪的质量，g。

1.2.3 单因素试验

提取温度的优化：称取500.00 g 预处理过的鹿脂肪原料，以鹿油提取率为评价指标，控制提取时间120 min，提取压力 40 MPa，CO2流量 12 L/h 恒定不变，改变提取温度分别为 30、35、40、45、50、55 ℃和 60 ℃，采用超临界CO2提取法提取鹿油，研究提取温度对鹿油提取率的影响。

提取压力的优化：称取500.00 g 预处理过的鹿脂肪原料，以鹿油提取率为评价指标，控制提取时间120 min，提取温度 40 ℃，CO2流量 12 L/h 恒定不变，改变提取压力分别为 25、30、35、40、45、50、55 MPa，采用超临界CO2提取法提取鹿油，研究提取压力对鹿油提取率的影响。

提取时间的优化：称取500.00 g 预处理过的鹿脂肪原料，以鹿油提取率为评价指标，控制提取温度40 ℃，提取压力 40 MPa，CO2流量 12 L/h 恒定不变，改变提取时间分别为 30、60、90、120、150、180、210 min，采用超临界CO2提取法提取鹿油，研究提取时间对鹿油提取率的影响。

CO2流量的优化：称取500.00 g 预处理过的鹿脂肪原料，以鹿油提取率为评价指标，控制提取时间120 min，提取温度40 ℃，提取压力40 MPa，改变CO2流量分别为 8、10、12、14、16、18、20 L/h，采用超临界CO2提取法提取鹿油，研究CO2流量对鹿油提取率的影响。

1.2.4 正交试验

影响超临界CO2提取的因素有很多，提取温度、提取压力、提取时间、CO2流量是影响超临界CO2提取法提取率的重要因素。在单因素变量条件下筛选出提取温度、提取压力、提取时间、CO2流量对提取率的影响水平，进行L9（34）试验设计，以提取率为检验指标，进行正交试验，进料500.00 g，见表1。

表1 L9（34）正交试验因素水平表Table 1 L9（34）orthogonal experiment factors and levels

1.3 试验方案

1.3.1 鹿油样品前处理

准确称取提取后的鹿油0.200 0 g，加入正己烷使鹿油完全溶解并定容至10.00 mL 容量瓶中，摇匀后用移液枪移取 50 μL 于 10 mL 试管中，加入 0.4 mol/L 的氢氧化钠-甲醇溶液2.00 mL 后，放置在漩涡振荡器中，振荡2 min，放置10 min 后再加入1.95 mL 正己烷于试管中，再将其放入旋涡振荡器振荡2 min，然后用质量分数为8.0 %的氯化钠溶液稀释至10 mL，以2 000 r/min 离心10 min 后吸出上清液于微量试管中，过0.45 μm 的微孔滤膜过滤后，再经过三氟化硼法进行脂肪酸的甲酯化处理[10]，最后取1 μL 样品进行GCMS 分析。

1.3.2 色谱条件

DB-5MS 毛细管柱（30 mm×0.25 μm×0.25 nm），进样口温度 250 ℃；程序升温：90 ℃持续 1 min，以 5 ℃/min至 140 ℃，再以 3 ℃/min 至 170 ℃，持续 1 min，最后以10 ℃/min 至 250 ℃，持续 5 min。载气：高纯氦气；流量1 mL/min；分流比 40 ∶1。

1.3.3 质谱条件

EI+离子源，离子能量70 eV；灯丝流量0.2 mA；离子源温度：230 ℃；接口温度：250 ℃；扫描质量范围：10 amu～550 amu。

1.3.4 图谱分析

样品经过GC-MS 分析后，以峰的保留时间及谱库检索进行定性分析，然后与相应标准峰面积进行比较完成定量分析得出鹿油主要的化学成份。

2 结果与分析

2.1 超临界CO2提取条件单因素试验

2.1.1 提取温度对鹿油提取率的影响

温度对鹿油提取率的影响见图1。

图1 温度对鹿油提取率的影响Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of deer oil

由图1 可得，在提取时间120min，提取压力40MPa，CO2流量12 L/h 恒定不变的条件下，随着提取温度的升高，鹿油的提取率上升趋势显著，当温度为45 ℃时，提取率达到最高。随着温度高于45 ℃时，提取率开始缓慢下降。

由于温度升高对对流传质系数的影响大于对溶解度的影响，提取率不断提升。而当温度高于45 ℃时，溶解度对鹿油提取率的影响高于对流传质系数的影响，提取率便开始下降。综合考量得出，鹿油提取温度以 40 ℃～50 ℃为最佳。

2.1.2 提取压力对鹿油提取率的影响

提取压力对鹿油提取率的影响见图2。

图2 压力对鹿油提取率的影响Fig.2 Effect of pressure on extraction rate of deer oil

如图2 可得，压力变化对鹿油提取率的影响较为明显。本试验中，控制提取温度为40 ℃，压力从25 MPa上升至40 MPa，鹿油提取率显著增加，当提取压力超过40 MPa，鹿油的提取率上升缓慢，但仍具有持续上升的趋势。

从量化生产的经济方面考虑，当压力高于40 MPa，提取系统需要经过特殊设计，会提高成本。从能源、经济等综合因素考量，鹿油提取压力以35 MPa～45 MPa为最佳。

2.1.3 提取时间对鹿油提取率的影响

提取时间对鹿油提取率的影响见图3。

图3 时间对鹿油提取率的影响Fig.3 The effect of time on extraction rate of deer oil

如图3 可得，提取时间对超临界CO2提取鹿油有显著影响。超临界提取属于扩散过程，需要一定时间才能提取充分。提取初期，由于溶剂的扩散速率缓慢，提取率较低，随着时间的延长，溶剂扩散能力增强，提取率不断增大。在控制提取温度40 ℃、提取压力40 MPa、CO2流量12 L/h 条件下，观察图3 可知，在30 min～150 min 时间内，提取时间越长鹿油提取率越高，鹿油提取率随着提取时间的增加而显著提高，但150 min后，随着提取时间的增加鹿油提取率基本趋于平缓，由此得到鹿油提取时间以120 min～180 min 为最佳。

2.1.4 CO2流量对鹿油提取率影响

CO2流量对鹿油提取率的影响见图4。

图4 CO2 流量对鹿油提取率的影响Fig.4 Effect of CO2 flow on extraction rate of deer oil

本试验中，各组试验控制在提取时间120 min，提取温度40 ℃，提取压力40 MPa 下进行，增大CO2流量，意味着更多CO2参与提取过程。如图4 可得，当CO2流量增大，萃取釜入口处的CO2流速增大，萃取釜中CO2的流动方向由于卷吸效应发生弯曲，CO2流量越大，卷吸效应越强，使得萃取釜中的原料与超临界CO2充分反应，使提取速率不断升高。综合考量得出，鹿油提取中CO2流量以12 L/h～16 L/h 为最佳。

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，采用四因素三水平的的正交设计方案，在9 种不同工艺条件下提取鹿油，分别测定其提取率，结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experiment results

表2 的极差分析结果表明，超临界提取4 个因素对鹿油提取率的影响顺序为：提取压力＞提取时间＞CO2流量＞提取温度，鹿油的最佳提取方案为A2B2C2D2，即最佳提取工艺条件组合为提取温度45 ℃，提取时间150 min，CO2流量 14 L/h，提取压力 40 MPa。

2.3 最佳提取条件验证

在上述最佳条件下进行3 次重复试验，其鹿油提取率分别为44.36%、45.21%和44.87%，得到平均提取率为44.81%，由提取率可看出，最佳提取工艺条件具有较好的重复性，鹿油提取率较高，说明该工艺条件是合理、可靠的。

2.4 鹿油成分分析

采用GC-MS 分析法对超临界CO2提取法所得到的鹿油脂肪酸甲酯液进行分析，得鹿油脂肪酸甲酯色谱图，如图5 所示。

将质谱图中的各色谱峰与谱图库标准谱图进行对照，确定其化学成分，同时采用面积归一化法定量分析计算出各成分的相对含量，结果见表3。

由表3 可知，鹿油中共鉴定出16 种脂肪酸，其饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸相对含量分别为69.840 9%、30.159 1%，不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸为0.431 8。

图5 鹿油脂肪酸甲酯色谱图Fig.5 Fatty acids methyl esters chromatogram of deer oil

表3 鹿油脂肪酸成分与含量Table 3 Compositions and contents of fatty acids in deer oil

其中主要脂肪酸为十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸及十八碳二烯酸。十六烷酸又称粽榈酸，在饱和脂肪酸中含量最高，其质量分数为48.85%，稳定性良好，是较好的食品强化剂和乳化剂，深受食品制造产业所喜爱，粽榈酸在洗涤用品领域也有广泛应用，主要用于制作肥皂和合成洗涤剂的原料；十八烷酸又称硬脂酸，是饱和的高级脂肪酸中的一种，其质量分数为15.03%，具有很好的润滑性和热稳定性，在食品工业中用作润滑剂、消泡剂及食品添加剂，在护肤品中起乳化作用，是化妆品的主要原料；十八碳烯酸又称油酸，在不饱和脂肪酸中含量最高，占总脂肪酸含量的13.83%，油酸的钠盐或钾盐是肥皂的主要成分之一。纯的油酸钠具有良好的去污能力，可用作乳化剂等表面活性剂，并可用于治疗胆石症等。此外十八碳烯酸还可用作抗静电剂、柔软润滑剂及乳化剂等，因此在化妆品和毛纺等工业中有广泛应用。根据GC-MS分析法检测的鹿油脂肪酸成分中，十七碳烯酸是不饱和脂肪酸中含量较少的，其质量分数为0.633 4%，在总脂肪酸中含量极低，对皮肤的刺激作用也就越小。

3 结果与讨论

采用超临界二氧化碳提取法提取鹿油，通过单因素试验得到最优的提取工艺。提取工艺为提取温度45 ℃、提取压力 40 MPa，提取时间 150 min，CO2流量14 L/h。此时鹿油的提取率为44.81%。

采用GC-MS 分析法对鹿油脂肪酸甲酯液的成分进行检测，确定其含有16 种脂肪酸，其中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸相对含量分别为69.840 9%、30.159 1%，主要脂肪酸有十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸及十八碳二烯酸。与井银成等[11]研究的猪油、鸡油主要脂肪酸含量相比较由超临界二氧化碳提取法对提取出的鹿油经甲酯化后，通过GC-MS 分析法检测，得到鹿油较其它油脂中的十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸含量较高，其中十六烷酸含量为48.85%，高于井银成等[11]报道的从猪油中提取出的十六烷酸含量，其质量分数为28.81%，鹿油中十八烷酸为15.03%，高于猪油中的9.01%，同时十七碳烯酸含量较低仅为0.633 4%。鹿油通过超临界CO2提取法提取出的鹿油具有明显的热稳定性、润滑性、乳化作用较其它同类动物油脂效果更好，对皮肤刺激性更小，更适用于日化领域的应用。