超声波辅助法提取百香果壳中黄酮的工艺及其抗氧化性研究

张会香，杨世军，蓝华生，蔡爱华

（1.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西桂林541006；2.桂林理工大学化学与生物工程学院，桂林广西541004）

百香果（passion flower）又称西番莲、鸡蛋果，属西番莲科，西番莲属植物，原产澳大利亚和巴西，属于热带多年生草质至半木质藤本攀附果树，现广泛分布于热带和亚热带地区，目前在中国的广东、广西、海南、福建等地有大量种植[1-2]。百香果果汁具有番石榴、菠萝、香蕉、芒果、苹果、酸梅等多种水果的令人愉悦的香味[3]。研究发现，百香果果壳中丰富的碳水化合物、多糖、黄酮和多酚类物质[4-5]。百香果果壳的乙醇、水提取物均能有效清除DPPH·和·OH，证明其提取物具有良好的抗氧化活性[5-7]。研究表明，黄酮类化合物是一类有着多方面药理作用和生物活性的物质，在预防癌症、抗过敏、抗炎症、抗病毒、抗糖尿病并发症等方面都具有活性，同时黄酮类化合物还是一种自然界存在的理想的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子的自由基、抗衰老、增加机体免疫等生物活性[8-9]。

目前对百香果应用除了部分鲜食之外主要用于加工果汁产品，因此，大量的果壳被作为残渣废弃掉，造成大量的浪费，同时又污染环境。

超声波辅助提取法又被称为超声波萃取或者超声波辅助萃取法，主要是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率的方法[10-12]。且超声辅助提取可节约溶剂，避免高温对提取成分的影响。因此，目前在天然植物有效成分提取中超声波辅助提取法被广泛应用。

因此，本文通过单因素试验及正交试验，利用超声波辅助乙醇提取法对百香果果壳中的黄酮类化合物进行提取并研究其抗氧化活性，为综合开发利用百香果果壳提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百香果果壳（紫果）：桂林市雁山镇。

无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、抗坏血酸、硝酸铝：以上试剂均为分析纯，西陇化工股份有限公司。

芦丁（rutinhydrate）对照品、DPPH：美国 sigma 公司；聚酰胺树脂（80 目～100 目）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

HH-S2 型数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；XH-300A 电脑微波超声波组合合成/萃取仪：北京祥鹄科技发展有限公司；HL-2B 型恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；电脑全自动部分收集器：上海琪特分析仪器有限公司；TU-1950 型双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；PB-10 型酸度计、BS2245 型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；FW100 型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；RE-2000A 型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理及制备过程

选择完整无破损的百香果，取下果壳，将其洗净、烘干、粉碎、过80 目筛，置于干燥器中备用。

称取一定量的干燥粉末样品，按照一定比例的料液比加入不同浓度的乙醇，在一定的温度和时间下进行超声波辅助提取，将提取液抽滤，滤液即为黄酮粗提液。采用聚酰胺柱层析法进行黄酮粗提取的纯化，上样流速为0.5 mL/min，用蒸馏水、70%乙醇溶液进行顺序洗脱，洗脱速度为1 mL/min，分段收集洗脱液，合并纯化液进行旋转蒸发浓缩，得到黄酮纯化液，测定黄酮含量，得到的样品纯度为20.08 %，回收率为82.95%。

1.3.2 黄酮含量测定方法

精确称量干燥至恒重的芦丁标准品10.23 mg，用60 %乙醇加热溶解定容至100 mL，得浓度为0.102 3 mg/mL 的芦丁标准溶液。参考陈志红等[13]报道的方法，以吸光度为纵坐标，芦丁浓度（mg/mL）为横坐标制作标准曲线。用最小二乘法做线性回归，得到芦丁浓度X 和吸光度Y 的关系曲线的回归方程Y=13.532X-0.001 6，R2=0.999 8，线性范围 5.115 μg/mL ～40.92 μg/mL。

准确吸取样品溶液1 mL，用60%乙醇定容至5 mL置于10 mL 容量瓶中，按标准曲线的制备方法测定其吸光度，根据回归方程计算黄酮含量C（mg/mL）。黄酮提取率为黄酮质量与百香果果壳样品质量之比。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

固定料液比为 1 ∶50（g/mL），超声功率 200 W，超声温度30 ℃，超声时间20 min，分别以30 %、40 %、50 %、60%、70%、80%的乙醇溶液为溶剂提取黄酮，比较不同浓度乙醇对提取率的影响。

1.3.3.2 料液比对黄酮提取率的影响

固定乙醇浓度60%，超声温度30 ℃，超声功率200 W，超声时间20 min，分别设定料液比为1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），比较不同料液比对提取率的影响。

1.3.3.3 超声功率对黄酮提取率的影响

固定乙醇浓度 60%，料液比 1 ∶40（g/mL），超声温度 30 ℃，分别以 160、200、240、280、320、360 W 的超声功率进行提取，比较不同超声功率对提取率的影响。

1.3.3.4 超声温度对黄酮提取率的影响

固定乙醇浓度 60%，料液比 1 ∶40（g/mL），超声功率 200 W，分别以 30、40、50、60、70、80 ℃的超声温度进行提取，比较不同超声温度对提取率的影响。

1.3.3.5 超声时间对黄酮提取率的影响

固定乙醇浓度 60%，料液比 1 ∶40（g/mL）超声功率 200 W，超声温度 60 ℃，分别以 20、30、40、50、60、70 min 的超声时间进行提取，比较不同超声时间对提取率的影响。

1.3.4 正交试验

在单因素的研究基础上，选用L16（45）正交表，以黄酮提取率为指标，设计正交试验，确定最佳提取条件。因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The experimental factors and levels of orthogonal test

1.3.5 黄酮抗氧化活性的测定

1.3.5.1 水杨酸法测定黄酮抗氧化活性

采用Fenton 试剂法[14]，在10 mL 试管中分别加入1.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL、9 mmol/L 水杨酸 1.00 mL，分别加入 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的百香果黄酮提取液，另一支试管以蒸馏水为参比，做空白试验比较，最后分别加9 mmol/L H2O21.00 mL 摇匀，加蒸馏水定容至10 mL，在37 ℃水浴中反应30 min，在510 nm 处测定吸光度。考虑到提取液自身的吸光度，按前述同样的方法，区别是不加H2O2，作为提取液的本底吸收AX0。同时配制相同浓度梯度的VC溶液为对照品，加入 1.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL、9 mmol/L 水杨酸1.00 mL、9 mmol/L H2O21.00 mL 摇匀，加蒸馏水定容至10 mL，在 37 ℃水浴中反应 30 min，在 510 nm 处测定吸光度。即为对照试验结果，与黄酮提取物比较抗氧化活性大小。

计算公式：

式中：A0为空白对照组吸光度；AX为样品组吸光度；AX0为提取液本底组吸光度。

1.3.5.2 DPPH 法测定黄酮抗氧化活性

参考王雅等[15]的方法在10 mL 试管中分别加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的百香果黄酮提取液和 3 mL现配的0.1 mmol/L DPPH 缓冲液，95 %乙醇定容至10 mL，混合均匀，另一只试管以95%乙醇为参比，做空白试验比较。同时配制相同浓度梯度的VC溶液进行对照试验。考虑到提取液自身的吸光度，按前述同样的方法，区别是不加DPPH，作为提取液的本底吸收Aj。

计算公式：

式中：AC为空白对照试验吸光度；Ai为样品吸光度；Aj为不加DPPH 提取液的本底吸光度。

1.3.5.3 邻苯三酚自氧化法测定黄酮抗氧化活性

参考陈志红[16]等的方法吸取不同浓度的黄酮提取液1 mL，分别加入pH8.2 浓度为50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液4.5 mL，随后加入4.2 mL 蒸馏水（自氧化）混匀，放置于25 ℃水浴锅内保温20 min 后取出，立即加入事先预热（25 ℃）的3 mmol/L 邻苯三酚0.3 mL（用10 mmol/L 的HCl 配制）。空白试验组加0.3 mL 10 mmol/L HCl 代替邻苯三酚溶液。加入试剂后迅速摇匀，倒入比色皿中，在325 nm 下测定5 min 后的测定吸光度。同时配制相同浓度梯度的VC溶液作为对照品进行试验。

计算公式：

式中：ΔA0为邻苯三酚自氧化的吸光度随时间的变化值；ΔAX为加入样品后溶液的吸光度随时间的变化值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

根据试验结果得出乙醇浓度对黄酮提取率的影响见图1。

图1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of flavonoids

由图1 可以看出，随着乙醇浓度的增大黄酮提取率也不断增大，在乙醇浓度为60%时黄酮提取率达到最大值，乙醇浓度超过60%提取率反而降低，说明百香果果壳中黄酮的极性与60%乙醇极性最接近，因此，可以最大程度地从固体材料中转移到溶剂中。因此确定60%乙醇溶液为最佳提取溶剂。

2.1.2 料液比对黄酮提取率的影响

根据试验结果得出料液比对黄酮提取率的影响见图2。

图2 料液比对黄酮提取率的影响Fig.2 The effect of ratio of material to solvent on extraction efficiency of flavonoids

由图2 可知，随着料液比的不断增大，黄酮的提取率也逐渐上升，当料液比上升到1 ∶40（g/mL）时，提取率达到最大，之后，提取率开始下降。这可能是由于溶剂量的不断增大，溶质与溶剂之间接触的表面积不断增加，加速了溶质的溶出，导致提取率增加。随着溶剂量不断加大到一定比例时，黄酮已经基本完全从固体组织转移到液体中。因此，试验选用1 ∶40（g/mL）的料液比作为最佳料液比。

2.1.3 超声功率对黄酮提取率的影响

根据试验结果得出超声功率对黄酮提取率的影响见图3。

图3 超声功率对黄酮提取率的影响Fig.3 The effect of ultrasonic power on extraction efficiency of flavonoids

由图3 可知，随着超声功率的不断增大，黄酮的提取率也不断升高，在超声功率240 W 时黄酮提取量最大，之后随着功率的增加，提取率趋于平稳。可能的原因为：在160 W 到240 W 之间，随着功率的增加，超声波的能量不断增大，分子运动不断加快，导致黄酮的提取率增大；超声功率超过240 W 后，过高的功率导致高温，反而破坏了黄酮分子，导致黄酮提取率降低。因此，选取240 W 作为试验的最佳超声功率。

2.1.4 超声温度对黄酮提取率的影响

根据试验结果得出超声温度对黄酮提取率的影响见图4。

图4 超声温度对黄酮提取率的影响Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on extraction efficiency of flavonoids

从图4 可以看出，黄酮提取率随超声温度增大而不断增大，在60 ℃时达到最大值，此后随着温度再升高提取率反而降低。这主要是因为溶剂分子运动速度与温度正相关，温度越高速度就越快。所以黄酮类溶质分子的扩散运动加快，溶解速度增加，导致提取率不断增加。而温度超过一定极限后，黄酮类物质分子结构被破坏，导致黄酮提取率降低，且温度过高容易导致物质活性丧失，因此选用60 ℃作为最佳提取温度。

2.1.5 超声时间对黄酮提取率的影响

根据试验结果得出超声时间对黄酮提取率的影响见图5。

图5 超声时间对黄酮提取率的影响Fig.5 The effect of ultrasonic time on extraction efficiency of flavonoids

由图5 可知，随着提取时间的增加，黄酮提取率不断增大，且在50 min 时达到最大值，之后变化趋于平稳。这主要的原因是：溶剂提取有效成分的动力是溶剂内外存在浓度差，在提取的初始阶段，浓度差较大，随着时间延长有效成分会迅速进入溶剂中，提取率就不断增大；随着时间继续延长浓度差会不断减小，提取率就基本保持不变了。因此，从经济的角度考虑，选取超声时间50 min 为最佳提取时间。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果设计正交试验，试验因素水平见表1，通过试验得出正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2 的极差分析可知，乙醇浓度对提取率的影响最大，各因素对黄酮提取效果影响的主次顺序为：乙醇浓度＞超声温度＞超声时间＞超声功率＞料液比，最佳提取工艺条件为A3B1C2D2E2，即60 %乙醇，料液比1 ∶30（g/mL），超声功率 240 W，超声温度 50 ℃，超声时间40 min。

因为最佳参数A3B1C2D2E2在正交试验中没有出现，所以进行验证试验，结果见表3。

表3 验证试验结果Table 3 The results of verification test

从表3 可以看出验证试验中黄酮的提取率为8.084 0 mg/g，大于正交试验的最大黄酮提取率7.914 6 mg/g，说明最佳提取工艺A3B1C2D2E2确为最佳。

对百香果果壳样品进行索氏提取，在90 ℃水浴锅中采用60%乙醇提取，待虹吸5 次后结束提取，用时3 h 10 min，黄酮提取率为5.669 5 mg/g。明显小于超声提取法黄酮提取率8.084 0 mg/g。因此，与索式提取方法相比，超声波辅助乙醇提取法具有用时更短，效率更高，成本更低等优点。

2.3 黄酮抗氧化活性的研究

2.3.1 水杨酸法测抗氧化活性

对不同浓度的黄酮提取物进行水杨酸法测定抗氧化活性，以相同浓度的VC做对照，试验结果见图6。

图6 黄酮对·OH 的清除率的影响Fig.6 The effect of·OH clearance on flavonoids

由图6 可知，随着浓度的不断增加，黄酮对·OH的清除率不断升高，在试验范围的最大浓度0.44 mg/mL时清除率达到58.66%，而同浓度的VC在清除·OH 自由基能力方面要明显小于黄酮，说明百香果果壳中黄酮对羟自由基有较好的清除能力。

2.3.2 DPPH 法测抗氧化活性

对不同浓度的黄酮提取物进行DPPH 法测定抗氧化活性，以相同浓度的VC做对照，试验结果见图7。

图7 黄酮对DPPH 自由基的清除率的影响Fig.7 The effect of the scavenging rate of DPPH on flavonoids

由图7 可以看出，在试验浓度范围内，随着黄酮浓度的不断增加，对DPPH 自由基的清除率从54.7%增加到93.81%。与同浓度的VC相比较，黄酮的清除率小于VC的清除率（95.42%），但可以看出，在最大浓度时，百香果黄酮对DPPH 自由基的清除能力接近于VC的清除水平。说明黄酮对DPPH 自由基有很强的清除能力。

2.3.3 邻苯三酚自氧化法测抗氧化活性

经试验发现，当样品浓度为0.044 mg/mL 时，黄酮与VC对超氧阴离子自由基的清除率高达100 %，无法做出比较。因此将样品浓度继续稀释至0.026 4、0.017 6、0.008 8 mg/mL 3 个浓度梯度，黄酮与VC对超氧阴离子自由基的清除率，结果见图8。

图8 不同浓度黄酮对O2-·的清除率的影响Fig.8 The effect of the clearance rate of O2-·on different concentrations of flavonoids

由图8 可知，百香果果壳中的黄酮和VC都对O2-·有清除作用，且清除效果与添加的剂量成正相关，随着样品浓度的增加，对O2-·的清除率也随着增大。试验结果说明黄酮清除O2-·自由基的能力略低于VC，但是黄酮的最大清除率仍然达到了82.61%，说明黄酮在清除超氧阴离子自由基方面同样表现出良好的抗氧化活性。

3 结论

通过试验确定了超声波辅助法提取黄酮的最佳工艺条件为50 ℃条件下，选择60%乙醇为提取剂、料液比 1 ∶30（g/mL）、超声 40 min，超声功率 240 W，此条件下提取的百香果果壳黄酮含量可达8.084 mg/g。与传统提取工艺相比，超声波辅助法明显提高了百香果果壳黄酮的提取效果和含量，提取效果优于乙醇回流提取工艺，是一种高效、节能、省时的提取百香果果壳黄酮工艺。

提取后的样品经过聚酰胺层析柱纯化，对纯化的黄酮化合物利用水杨酸法测定对羟基自由基的清除能力、DPPH 法与邻苯三酚自氧化法来测定超氧阴离子自由基的清除能力，发现黄酮浓度为0.44 mg/mL时，对羟基自由基的清除率可达58.66%；对DPPH 自由基的清除率可达93.81%；对超氧阴离子自由基的清除率甚至可达100%。相比较于同浓度的VC而言，黄酮对羟基自由基的清除能力远远大于VC；对DPPH自由基的清除能力相当；对超氧阴离子自由基的清除能力低于VC。试验结果证明了百香果果壳黄酮具有较强的抗氧化能力，是一种理想的天然抗氧化剂。