基于UPLC-TQ-MS对苦豆子中生物碱类成分定性分析方法的研究

陈龙，曲丽媛，刘雪滢，王航宇，张珂*，王金辉,3

(1 石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子 832002； 2 哈尔滨医科大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150081； 3深圳弘汇医药科技有限公司，广东 深圳 518000)

苦豆子(Sophoraalopecuroides)为豆科(Leguminosae)槐属植物，其全草、根及种子均可入药，最早在《神农本草经》中记载苦豆子药材具有清热解毒、抗菌消炎、利尿去火、止痛镇静等功效，现代药理学研究苦豆子中生物碱具有良好的药理作用，如苦参碱具有保护心血管系统[1]、抗肝损伤[2]、抗肿瘤[3]等作用。郝伟亮等[4]结合2005—2015年苦豆子相关文献，对苦豆子化学成分和药理作用进行综述，吐尔孙阿衣等[5]对苦豆子定量定性方法、提取方法以及临床应用进行进行简单综述。目前研究表明，苦豆子药材中含有20多种生物碱，含量约为6.11%～8.03%，其结构属于喹诺里西啶类，根据母核结构不同，分为苦参碱型、苦豆碱型、金雀花碱型、鹰爪豆碱型和羽扇豆碱型、苏苦西碱型6类生物碱，且不同类型的生物碱结构十分相似[6]。

由于中药中成分复杂，传统的提取分离方法费时耗力，传统的鉴别方法仅能够对药材中某几种成分进行定性或定量分析，缺乏对其系统化的研究。本研究结合相关文献和数据库，对苦豆子分子离子峰和特征碎片离子进行解析，推断化学结构和可能存在的化合物。旨在建立一种超高效液相色谱串联三重四极杆质谱方法(ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole-Mass Spectrum，UPLC-TQ-MS)定性分析苦豆子药材成分的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器及耗材

超高效液相-质谱联用仪(Waters ACQUITY UPLC-Xevo TQ-MS，美国Waters公司)，实验制水机(Milli-Q Advantage A10，美国Millipore公司)、超声仪(KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)、涡旋混合仪(IKA3617025，德国IKA公司)。

BakerbondTMSPE 固相萃取柱(C18-3 mL，美国J.K.Baker公司)、一次性油系滤器(尼龙膜，0.22 μm，13 mm，Biosharp公司)

1.2 材料

苦豆子经鉴定为豆科槐属植物苦豆子SophoraalopecuroidesL.的干燥果实。

1.3 试剂

乙腈、甲醇和甲酸均为质谱级(美国霍尼韦尔公司)，实验用水为实验室自制(电阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.4 供试品样品的制备和净化

将干燥的苦豆子药材粉碎，过40目筛，精密称取1.0 g粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，室温下超声提取30 min，取上清液离心(8000 r/min，10 min),吸取离心后上清液过SPE柱净化。

分别吸取甲醇、水5 mL活化平衡SPE柱，吸取待净化的上清液1 mL注入SPE柱内，甲醇2 mL洗脱供试品，收集洗脱液，过0.22 μm滤膜，进样分析。

1.5 实验条件

液相条件：色谱柱Waters ACQUITY BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)，柱温：35 ℃，样品池温度：4 ℃，流速0.2 mL/min；流动相：A-乙腈，B-0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱(0～16 min，10%～35% A；16～16.5 min，35%～95% A；16.5～20 min，95%～95% A)。

质谱条件：(1) 离子源为电喷雾离子源(ESI)，正离子模式检测，质量扫描范围(m/z)50～1200 Da，毛细管电压 2 kV，锥孔电压 50 V，离子源温度 150 ℃，脱溶剂温度 450 ℃，脱溶剂气流速 550 L/h；(2) 依据文献和数据库筛查建立子离子MS/MS全扫描，方法为：设定其母离子质量，质量扫描范围(m/z)50～1200 Da，碰撞能量范围(V)30～50，其余质谱参数同 (1)；(3) 依据 (2) 中选择相应的共用离子对，建立母离子MS/MS全扫描，方法为：设定其子离子质量质量扫描范围(m/z)50～1200 Da，碰撞能量范围(V)30～50，其余质谱参数同 (1)。

1.6 质谱检测分析

首先参考文献和数据库筛查建立子离子MS/MS全扫描质谱分析方法，根据母离子和特征离子信息解析确定质谱裂解规律，再根据以上信息确定化合物结构。最后根据共用离子对进行母离子MS/MS全扫描分析，根据以上裂解规律和母离子信息推测可能存在的未知化合物，图1为正模式下苦豆子总离子流色谱图。

图1 苦豆子正模式下总离子流色谱图Fig.1 Total ion flow chromatography of sophora alopecuroides in positive mode

2 结果

2.1 质谱裂解规律和结构解析

2.1.1 四环型苦参碱类的质谱裂解规律

质谱裂解途径见图2，可知其裂解方式可能为两种，其一是失去2个H形成分子内双键(m/z247)，接着失去一分子C3H3NO，产生特征离子(m/z176)，失去一分子C2H2，得到特征离子(m/z148)，最后中性碎片(CH2)丢失得到(m/z122)。其二是先发生β裂解和分子内重排，得到特征离子(m/z148)，接着发生RDA裂解，得到(m/z112)，最后中性碎片丢失得到(m/z98)。

根据以上裂解规律分析质谱检测结果，m/z176和148碎片离子的存在可作为判断四环苦参碱型成分的依据，表1中所列四环苦参碱型化合物都基本满足该条件，结合相关文献和数据库筛查[7-8]，可判断其结构式。

如图3质谱图中信息可知，其母离子离子峰m/z249.24、m/z148.03 [M+H-C5H10NO]、m/z111.80 [M+H-C8H10NO]和m/z86.07 [M+H-C10H12NO]推测其为苦参碱或槐定碱。

图2 苦参碱-四环型化合物质谱裂解规律Fig.2 Mass spectrometric fragmentation of matrine-tetracyclic compounds

图3 苦参碱-四环型化合物质谱图谱Fig.3 Mass spectrogram of matrine-tetracyclic compounds

2.1.2 鹰爪豆碱-四环型的质谱裂解规律

鹰爪豆碱质谱裂解规律见图4。其质谱裂解规律归纳为，首先发生β裂解和分子内重排得到(m/z186)，接着中性碎片丢失得到特征离子(m/z148)，m/z148可发生结构互变，经过一系列的中性碎片丢失，得到(m/z112;98)。四环苦参碱类和鹰爪豆碱类化合物在质谱裂解行为中都会出现失去2个H，形成具有双键结构的季胺离子，这种离子的裂解与没有失去2个H的离子的过程基本一致，都会发生一系列的中性碎片丢失。根据以上质谱裂解规律分析质谱检测结果，从图5中可知，其母离子离子峰m/z233.10、经过一系列中性碎片丢失得到m/z98.00，推测其结构为苦豆碱[9]。

图4 鹰爪豆碱-四环型化合物质谱裂解规律Fig.4 Mass spectrometric fragmentation of sparteine-tetracyclic compounds

图5 鹰爪豆碱-四环型化合物质谱图谱Fig.5 Mass spectrogram of sparteine-tetracyclic compounds

2.1.3 金雀花碱-三环型化合物质谱裂解规律

根据其质谱裂解规律，分析质谱检测结果，由图7中信息可知，其母离子离子峰m/z191.22，经过一系列裂解得到特征离子峰m/z160.20、148.16和134.16，推测其可能为金雀花碱结果如图6所示。

图6 金雀花碱-三环型化合物质谱裂解规律Fig.6 Mass spectrometric fragmentation of sophorine-tricyclic compounds

图7 金雀花碱-三环型化合物质谱图谱Fig.7 Mass spectrogram of sophorine-tetracyclic compounds

总结以上裂解规律，并对其质谱检测结果进行分析，分别鉴定了苦参碱-四环型、鹰爪豆碱-四环型、金雀花碱-三环型和羽扇豆碱-二环型这四类化合物，并归纳总结如表1所示，因TQ-MS/MS无法对一类别的同分异构体进行分别，因此，其同分异构体仍需要其他分析方法进行区分。

表1 苦豆子化学成分分析结果Tab. 1 Analysis of chemical constituents of sophora alopecuroides

2.2 根据质谱裂解规律对未知化合物的表征

本研究共鉴定出8个未知化合物，如图8所示，对比于已报道的文献，发现为苦豆子中首次被发现的化合物。

化合物(1)根据其质谱图中显示特征离子m/z177.07、122.02和m/z527.43[2 M+H]，考虑到生物合成和与氧化槐果碱裂解途径类似，推测其氧自由基被还原成羟基，其分子式为C15H22N2O2，其可能结构如图8所示。

化合物(5)和(6)与氧化苦参碱质谱裂解规律相似，其都有特征离子m/z247.17;178.04;121.95，考虑其极性及质谱图差异，其结构如图8所示。

化合物(2)、(3)、(4)除都有m/z247.17;178.04;121.95这些特征离子外，还显示存在m/z279.37、264.32和m/z280.81、265.01这种类似的离子对，依据前面所述这类生物碱都会发生中性碎片丢失和失去2个H的质谱裂解，且都是成对存在于整个裂解过程中，因此，推测其可能连有甲基，结构如图8所示。

图8 预测苦豆子中未知化合物结构Fig.8 Prediction of unknown compounds in sophora alopecuroides

3 讨论

本实验首次采用UPLC-TQ-MS/MS方法对苦豆子中化学成分进行快速鉴别，共定性分析了四类生物碱成分，深入研究并总结其中三类生物碱的质谱裂解规律；基于其质谱裂解规律，推测出了7种可能的苦豆子未知化合物。但本研究无法快速区分其生物碱类同分异构体，需要结合其他分析手段进行区分。

本研究采用正模式下MS/MS检测分析的方法，而并没有采用负模式的检测分析方法，原因为：实验选用ESI电喷雾离子源，是质谱中常用的软电离源，在正模式下，检测物可以得到正电荷，形成离子[M+H]+、[M+K]+或[M+Na]+；在本实验中主要检测的是生物碱，容易得到离子而带正电荷，根据质谱离子源的电离方式和生物碱在质谱分析的电离规律，生物碱易在正电离模式下得到电荷而形成正离子，如果本实验采用负模式的分析方法，被检测的生物碱既不易被质谱打碎形成带有负电荷的离子，且由于选择的电离方式不妥影响质谱分析灵敏度，可能丢失被测物中微量的化学成分信息；因此选择正离子模式分析苦豆子化合物。

目前，苦豆子中总生物碱的常用检测方法为薄层色谱和HPLC检测法，李永春[10]对提取得到的总生物碱提取液进行薄层色谱定性分析，以乙酸乙酯-乙醇-氨水(5∶1∶0.5)为展开系统，碘化铋钾为显色剂一次可以分析出8个总生物碱提取物内的单体化合物，但需要与单体化合物标准点比对；高红英[11]采用HPLC法检测了不同采收期内苦豆子中苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、9α-OH苦参碱和苦豆子碱A含量，但对其他化合物无法进行表征，具有一定的局限性；本研究采用UPLC-TQ-MS方法对苦豆子中生物碱成分进行定量分析，具有以下优势：(1) 针对传统提取方法的不足，本方法仅需超声提取即可用于检测分析，与传统提取分离方法相比具有操作简单、分析快捷和节约成本等特点。(2) 传统的检测方法如薄层色谱[12]和HPLC[13]法，虽然可以分析苦豆子中部分生物碱，但对于苦豆子系统性化学成分的分析仍有所欠缺，且传统检测方法需要价格昂贵的标准品作为参考，本研究仅需要其中几种标准品作为参照确定结果准确性，即可对苦豆子中可能存在的化合物进行表征。(3) UPLC与HPLC相比具有分析时间短，进样量少等特点，质谱分析具有灵敏度高、检测限低等特点，本研究采用UPLC-TQ-MS方法可以对苦豆子中含量极低的成分进行检测，这是其他分析方法不具备的特点。同时，苦豆子中化学成分的含量随季节更替也有一定的变化[14]，采用高灵敏度、低检测限、检测时间短的分析方法可以得到更加全面准确的结果。因此，本研究可为定性分析研究苦豆子药材生物碱类化学成分提供可靠依据。