补益肺肾汤对哮喘模型大鼠血清及肺组织炎症因子的影响▲

2020-03-20 08:27苏玉明群宋倩男王昕宇李美蓄
广西医学 2020年1期
关键词:异丙补益生理盐水

陈 宏 张 伟 苏玉明 李 全 陈 群宋倩男 王昕宇 李美蓄 张 菁 刘 征

(1 黑龙江中医药大学附属第一医院儿一科,哈尔滨市 150040,电子邮箱:chenhong667788@163.com;2 黑龙江中医药大学附属第一医院,哈尔滨市 150040;3 黑龙江省哈尔滨市阿城区人民医院检验科,哈尔滨市 150300)

哮喘是临床常见病、多发病,其患病率和病死率一直呈逐年增高的趋势[1],近年来一直是国内外医学界研究的热点。哮喘不仅可造成患者日常活动受限,而且会导致患者的情绪、心理和社会功能等多方面的损害,对患者的健康构成严重的威胁[2]。由于临床研究受伦理学的限制,通过动物实验探索有效治疗变应性哮喘的可行方法,具有重要的临床指导意义[3]。本研究选择SD大鼠作为研究对象,探讨补益肺肾汤对哮喘大鼠气道炎症反应的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠112只,7~8周龄,体重(200±10)g。饲养环境:温度(23±2)℃,湿度50%,自动光控12 h/12 h明暗周期(开灯时间为8:00 AM,关灯时间为8:00 PM),光照强度适中(约为100 lx),动物可自由获取食物、水和活动。

1.2 实验动物的筛选及分组 将SD大鼠放于自制的密闭玻璃箱内,超声雾化0.5%的磷酸组胺盐生理盐水溶液刺激大鼠,观察大鼠吸入组胺后的呼吸变化情况,选择吸入组胺后20 s内出现呼吸急促,前肢缩抬,点头或腹式呼吸等哮喘症状的大鼠作为试验用鼠。共筛选出105只大鼠,将其按照随机数字表法分为7组,包括正常对照组、模型组、生理盐水组、补益肺肾汤高剂量组、补益肺肾汤中剂量组、补益肺肾汤低剂量组、异丙肾上腺素组,每组15只。

1.3 主要药物、试剂及仪器

1.3.1 药物:补益肺肾汤药方组成包括黄芪20 g、丹参15 g、太子参15 g、麦冬15 g、五味子10 g、陈皮10 g、姜半夏10 g、川贝母8 g、炒苏子8 g、乌梅15 g、地龙10 g、磁石8 g、补骨脂8 g、紫河车8 g、桃仁8 g、瓜蒌仁10 g。将上述药物在实验室制成煎剂,经蒸馏水常规煎煮分别浓缩至每毫升含0.5、1.0、2.0 g生药(分别对应低、中、高剂量),4℃保存备用,使用时可稍加热。异丙肾上腺素(国药准字:H31022037)购自上海大众药业有限公司。

1.3.2 试剂:卵清蛋白、伊文思蓝均为美国Sigma公司生产,吸附无细胞百白破联合疫苗为武汉生物制品研究所生产,生理盐水,乙醚、丙酮、结晶氯化铝为上海苏燃化学试剂公司生产,氢氧化钠为天津科密欧化学试剂公司生产,大鼠卵清蛋白特异性IgE试剂盒为美国R&D公司生产。IgE、白细胞介素(interleukin,IL)-2、IL-4、IL-5和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)定量夹心酶联免疫吸附检测试剂盒均购自上海西唐生物有限公司,核因子κB免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3.3 仪器:ELX 800UV型酶标仪为美国Bio-Tek公司生产;LRH-250A型生化培养箱为广东省医疗器械厂生产;UV9600型紫外/可见光分光光度计为北京瑞丽分析仪器公司生产。

1.4 动物模型建立方法

1.4.1 氢氧化铝凝胶的配制:(1)称取精制明矾50 g,加入蒸馏水500 mL,加热搅拌使之完全溶解;称取氢氧化钠14 g,加入蒸馏水84 mL;(2)称取酚酞0.01 g,加入95%酒精1 mL配制成1%的酚酞酒精溶液;(3)称取氯化钡,加入蒸馏水配置成10%的氯化钡溶液;(4)向明矾溶液中加入配好的1%的酚酞酒精溶液0.4 mL;(5)将配制好的氢氧化钠溶液缓慢地加入明矾溶液中,此时会有大量絮状沉淀析出,在加入氢氧化钠溶液的过程中要不断地搅动,直至混合液为红色并不再消失为止,然后任其自然沉淀;(6)当沉淀物占总体积一半后,弃去上清溶液,用蒸馏水加至原体积,并搅拌均匀,此过程重复3次,反复洗涤沉淀两次后收集,即得氢氧化铝凝胶。

1.4.2 模型建立:(1)致敏阶段。分别于第1天、第14天,将新鲜配制的含1.0%卵清蛋白1 mg及10%氢氧化铝凝胶1 mg的生理盐水混悬液共1 mL,皮下注射于模型组、生理盐水组及各治疗组大鼠四肢内侧,每点各0.2 mL,并腹腔注射0.2 mL,同时腹腔注射1 mL灭活百日咳杆菌5×9 ,正常对照组按照上述同样途径给予注射生理盐水。(2)激发阶段。模型组与各治疗组,于第21天以1.0%卵清蛋白进行雾化吸入,激发哮喘,每次雾化25~30 min,连续7 d。密切观察大鼠有无持续口唇黏膜发绀、腹肌痉挛、频繁喘息、喷嚏、呛咳、抓耳挠腮、烦躁不安等行为学改变则为建模成功。

1.5 给药方法 (1)不同剂量补益肺肾汤组:于每次激发前30 min以不同剂量的补益肺肾汤灌胃给药,以10 mL/(kg·d)灌胃。(2)生理盐水组:于每次激发前30 min,给予同体积的生理盐水灌胃。(3)异丙肾上腺素组:于每次激发前30 min,尾静脉注射盐酸异丙肾上腺素0.5 mg/kg。(4)模型组及正常对照组:均给予等量生理盐水灌胃。

1.6 观察指标 末次抗原激发30 min后颈椎脱臼处死大鼠,摘眼球取血,将血液置于抗凝管中,静置30 min后,1 500 r/m离心15 min,取血浆,-20℃保存待检。取完血浆后消毒大鼠胸部皮肤,逐层打开胸部皮肤及胸骨,去除部分肋骨,充分暴露肺脏,手术线结扎右肺门。沿肺门剪下右肺,磷酸盐缓冲液漂洗后,将右肺副叶、后叶固定于4%多聚甲醛溶液中,常规脱水、石蜡包埋、切片,苏木精-伊红染色待检。采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清lgE及IL-4,肺组织IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α水平,免疫组化检测肺组织核因子κB活化情况。

1.7 统计学分析 采用SPSS 24.0统计学软件分析。计量资料以(x±s)表示,组间比较采用独立t检验;计数资料以例数(百分比)表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 7组大鼠血清IgE和IL-4水平比较 正常对照组和各剂量补益肺肾汤组血清IgE、IL-4水平均低于模型组,补益肺肾汤低剂量组血清IgE、IL-4水平均高于中剂量组,异丙肾上腺素组血清IgE、IL-4水平高于正常对照组及补益肺肾汤高剂量、中剂量组(均P<0.05)。见表1。

表1 7组血清IgE和IL-4水平比较(x±s,ng/mL)

注:与正常对照组及各剂量补益肺肾汤组相比,*P<0.05;与正常对照组及高剂量、中剂量补益肺肾汤组比较,&P<0.05;与补益肺肾汤中剂量组比较,#P<0.05。

2.2 7组大鼠肺组织IL-2、IL-4和IL-5水平比较 正常对照组和各剂量补益肺肾汤组肺组织IL-2、IL-4和IL-5水平均低于模型组和生理盐水组,补益肺肾汤低剂量组肺组织IL-2、IL-4和IL-5水平均高于补益肺肾汤中剂量组,异丙肾上腺素组肺组织IL-2、IL-5水平均高于正常对照组、补益肺肾汤高剂量、中剂量组(均P<0.05)。见表2。

表2 7组肺组织IL-2、IL-4和IL-5水平比较(x±s,ng/mL)

注:与正常对照组及各剂量补益肺肾汤组相比,*P<0.05;与正常对照组及高剂量、中剂量补益肺肾汤组比较,&P<0.05;与补益肺肾汤中剂量组比较,#P<0.05。

2.3 7组大鼠肺组织TNF-α和核因子κB水平比较 正常对照组和各剂量补益肺肾汤组肺组织TNF-α和核因子κB水平均低于模型组和生理盐水组,补益肺肾汤低剂量组肺组织TNF-α和核因子κB水平水平均高于中剂量组,正常对照组及补益肺肾汤高剂量、中剂量组肺组织TNF-α和核因子κB水平均低于异丙肾上腺素组(均P<0.05)。见表3。

表3 7组肺组织TNF-α和 核因子κB水平比较(x±s)

注:与正常对照组及各剂量补益肺肾汤组相比,*P<0.05;与正常对照组及高剂量、中剂量补益肺肾汤组比较,&P<0.05;与补益肺肾汤中剂量组比较,#P<0.05。

3 讨 论

哮喘,是一种由淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种炎症细胞介导的气道慢性炎症,常存在气道高反应性和广泛的可逆性气流阻塞。哮喘的发病机制主要与 Ⅰ 型变态反应有关,主要免疫学特征是血清总IgE和特异性IgE的增高,而IgE可以介导肥大细胞脱颗粒而诱发哮喘的发作。变应原交联引起的膜受体变位激活肥大细胞/嗜碱性粒细胞后,细胞膜磷脂甲基化作用使得胞膜的通透性增加,钙通道开放,胞外钙离子进入胞内,并将激活信息传入,再激活胞内酶系列。

中医学认为,本病与体质因素、生活环境、饮食、情志有密切关系,内因在于肺、脾、肾不足,而外因在于感受外邪、饮食失调或情志不畅等。肺、脾、肾等脏腑功能失调,津液运化输布障碍,聚而生痰,留宿于肺,闭阻气道,肺气不利,血行不畅而血滞成瘀,痰瘀交结,蕴伏于内,成为哮喘之宿本。体内伏痰、遇诱因而触发,使气机升降出纳失常,乃是本病病机之根本。临床上,在哮喘患者中肺肾气虚证候非常多见[4]。补肾法已不拘于“急则治标,缓则治本”的传统原则,而广泛运用于变应性哮喘各期[5-6]。补益肺肾汤通过多环节、多层次、多途径治疗哮喘,这种整体调节的优势为中医治疗本病,特别是在远期防治具有广阔的应用前景。

研究哮喘的发病机制时,哮喘的动物模型大多是由接触过敏原引起的过敏性气道炎症模型[7-8]。因此,本研究应用氢氧化铝联合卵清蛋白建立哮喘大鼠模型,并采用补益肺肾汤进行治疗。 结果显示,正常对照组和各剂量补益肺肾汤组血清IgE和IL-4水平,肺组织IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α和核因子κB均低于模型组,且正常对照组及补益肺肾汤中剂量、高剂量组的血清IL-4、肺组织IL-2、IL-5、TNF-α、核因子κB均低于异丙肾上腺组(均P<0.05),这提示补益肺肾汤可抑制哮喘大鼠体内的炎症反应,且效果优于异丙肾上腺素。此外,与中剂量和高剂量补益肺肾汤组相比,低剂量补益肺肾汤组血清IgE和IL-4水平,肺组织IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α、核因子κB水平均升高(均P<0.05),而中、高剂量组上述指标比较均无明显差异(均P>0.05),提示中、高剂量的补益肺肾汤的效果可能比低剂量更好。

总之,补益肺肾汤能可降低哮喘大鼠血清及肺组织的炎症因子水平,从而减轻气道炎症,其中中、高剂量的效果更好。因此,在西药常规治疗的基础上,可加用中药补益肺肾汤治疗哮喘,可起到解痉平喘、肃邪宣肺效果,从而改善患者预后明显改善。

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