三带喙库蚊微卫星标记的筛选及遗传多样性分析*

褚宏亮 吴治明 田 野 高 剑 周明浩** 赵彤言**

(1.江苏省疾病预防控制中心，江苏南京 210009；2.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京市虫媒病与自然疫源性疾病重点实验室，北京 100071)

三带喙库蚊Culextritaeniorhynchus是亚洲的常见蚊种，能够传播多种虫媒病毒，如裂谷热病毒、西尼罗病毒和登革热病毒等，更是日本脑炎病毒(Japanese encephalitis，JE)的主要传播媒介(Selfetal., 1973)。三带喙库蚊偏向孳生于富含植物的水体中，其中稻田是其主要孳生地(李春晓等，2007)。中国作为一个粮食大国，在过去的几十年中，水稻的种植范围在全国范围内大幅度地增长，成为了世界第二大粮食种植基地(Ghose, 2014)。由此，引起的三带喙库蚊种群密度的增长也引起了人们对相关虫媒传染病流行的担忧。

微卫星标记(simple sequence repeats, SSRs)是一类广泛存在于原核和真核生物基因组非编码区中的短重复序列，该序列一般由6个以内碱基组成，且由于序列在不同个体中重复次数的差异而表现出高度的多态性(Vieiraetal., 2016)。目前，对于埃及伊纹Aedesaegypti、白纹伊蚊Aedesalbopictus和尖音库蚊复合组CulexpipiensComplex微卫星标记的研究等均有大量报道，而在三带喙库蚊研究方面仍为空白(Julieetal., 2005；Lovinetal., 2009; Renkeetal., 2020)。为便于今后开展三带喙库蚊种群的遗传结构和多样性的动态检测，本研究应用磁珠富集法进行三带喙库蚊微卫星标记的开发，同时对所得的遗传标记进行遗传多样性评估。

1 材料与方法

1.1 蚊虫采集

2015年7—8月，在江苏省16个不同地区猪圈、牛棚或稻田等适宜区域，采用诱蚊灯法或二氧化碳诱蚊灯法进行三带喙库蚊采集，采集时间为6:00 pm～8:00 pm。采集完成后用乙醚麻醉并分类鉴定。最后将挑选的三带喙库蚊按地区编号后放入-70℃冷冻保存，用于后续的基因组提取。

1.2 实验试剂和仪器

实验试剂：Qiagen blood and tissue kit (69504)、Taq酶(Takara)、EcoRⅠ、MseⅠ、MagneSphere Magnetic Separation Products kit (Promega)、用生物素标记的探针(AG)15和(GT)15、无水乙醇以及琼脂糖等。

实验仪器：超净工作台(SW-CJ-1D)、全自动制冰机(SANYO SIM-F14)、立式自动电热压力蒸汽灭菌锅(LDZX-40B)、高速台式冷冻离心机(TGL-16G)、电泳仪(DYY-6B)、凝胶成像分析仪(GELl-DOC2000)、Bio-Rad PCR扩增仪、3730XL测序仪(Applied Biosystems, USA)等。

1.3 三带喙库蚊基因组提取及质量检测

随机选取5个地理株用作微卫星引物开发及多态性验证。蚊虫基因组提取按照DNA提取试剂盒的说明书进行(Shietal., 2017)，而后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop核酸检测仪分别对三带喙库蚊基因组DNA的完整性、浓度以及纯度进行检测。

1.4 三带喙库蚊SSR引物开发和验证

1.4.1基因组酶切和接头连接 在37℃下利用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ对三带喙库蚊基因组DNA进行双酶切处理，处理时间为3 h，酶切体系为50 μL，其中包含基因组DNA 1 μg、10×T4 DNA ligase Buffer 5 μL、EcoRⅠ(10 U/μL) 1 μL 以及MseⅠ(10 U/μL) 1 μL，剩余部分用水补齐。基因组酶切产物与EcoRⅠ接头和MseⅠ接头于4℃连接过夜，连接体系为20 μL，其中包括酶切产物7 μL，EcoRⅠ接头75 pmol、MseⅠ接头75 pmol、T4 DNA ligase 1.5 U、10×T4 DNA ligase Buffer 2 μL以及ddH2O 10.5 μL。

1.4.2连接产物的预扩增 PCR扩增体系为20 μL，含连接接头的酶切DNA 2 μL、2×PCRmix 10 μL、E00 10 pmol、M00 10 pmol、Taq酶0.2 U，其他用水补齐。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s、50℃退火45 s、72℃延伸45 s、30次循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.4.3(AG)15和(GT)15探针杂交和磁珠捕捉 用生物素标记的探针(AG)15和(GT)15进行杂交：将200 pmol探针与100 μL PCR产物在沸水中变性5 min后，立即置于冰上10 min，加入2.5 μL 20×SSC混合液，在62℃水浴锅中杂交30 min，取出于室温冷却。将杂交混合液和平衡好的磁珠混匀，在室温放置10 min，每2～3 min轻轻摇动一下，使生物素充分吸附在包被亲和素的磁珠上，而后用0.1×SSC清洗磁珠4次，最后加入100 μL灭菌ddH2O进行洗脱。

1.4.4富集产物的扩增、克隆以及阳性克隆的筛选 富集产物扩增反应程序为：94℃变性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环5次；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增产物纯化并冷冻干燥浓缩至约6 μL，产物与pMD18-T(TaKaRa, D103 A)载体连接，连接体系为12 μL，其中含5.5 μL PCR产物，1 μL pMD18-T载体(50 ng/ μL)，6 μL Solution I，于16℃连接过夜。而后将12 μL连接产物加入150 μL感受态细胞于42℃水浴中热激90 s，迅速移入冰中，静置5 min，加入900 μL LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，150 r/min培养1 h。分别取100、200、300以及400 μL恢复培养液涂于含氨卞青霉素的LB培养皿上，倒置于37℃培养过夜。用pMD18-T载体的通用引物M13-47(C G C C A G G G T T T T C C C A G T CA-CGAC)或RV-M(G A G C G G A T A A C A A T TT C A C A CAGG)分别与重复序列(AG)9组成的双引物对AG富集文库菌落进行筛选检测。反应程序为：94℃预变性10 min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环33次；72℃延伸10 min，4℃保存；取5 μL PCR产物用于2%琼脂糖凝胶电泳检测，对扩增出清晰电泳条带的菌落进行质粒测序。

1.4.5序列分析和SSR引物筛选 利用Chromas软件对序列峰图进行手工校正，并筛选出含有SSR位点的序列。而后利用DNAman软件去除载体和接头序列，CodonCode Aligner软件进行序列比对分析，去除重复序列后，用Primers 5.0软件进行SSR引物设计。采用丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对初筛合格引物进行复筛，检测样本数量为5，筛选具有扩增多态性的引物为复筛合格引物。

2 结果

2.1 三带喙库蚊基因组检测

三带喙库蚊基因组DNA的电泳结果显示：基因组DNA条带单一且明亮，同时，基因组DNA的吸光度值检测结果显示：所有检测样本DNA的OD260/280值均位于1.6～2.0之间，且DNA浓度值为60～100 ng/μL，这表明本研究提取的三带喙库蚊基因组较完整且浓度较高；基因组DNA双酶切产物的电泳图呈现弥散状，这表明获得的SSR短基因组DNA质量适合后续的实验(图1)。

2.2 微卫星位点检测和多态性验证

本实验共挑选了100个阳性克隆进行测序(图2-a)，测序结果经SSR Hunter软件分析共获得了40个含有微卫星位点的序列，这些微卫星位点的PAGE多态性验证结果表明：有24个位点在不同三带喙库蚊地理株间呈现高度的多态性，这些位点引物的GenBank登记号为：MW340914 ～ MW340937 (图2-b～f,表1)。

图1 三带喙库蚊基因组和基因组酶切产物电泳图

表1 三带喙库蚊微24个卫星位点及序列信息

2.3 微卫星位点遗传多样性分析

本研究从24个微卫星多态性位点中选取10个进行了遗传多样性评估，结果表明：这些位点的等位基因数(Na)在9～27之间，平均等位基因数为18；观察杂合度(Ho)在0.437～0.823之间，平均观察杂合度为0.653，而期望杂合度(He)在0.530～0.857之间，平均期望杂合度为0.752。各位点的平均多态信息含量(PIC)和香农指数(SI)结果基本一致，其中P17最高(PIC=0.853，SI=2.281)，最低的为P40(PIC=0.503，SI=1.195)，都属于高度多态性位点(表2)。

图2 三带喙库蚊微卫星位点多态性验证

表2 三带喙库蚊10个微卫星位点遗传多样性分析

3 讨论

在传统研究中，研究人员常通过文献和相关数据库检索以及近缘物种交叉扩增的方法获取微卫星引物，然而，对于三带喙库蚊微卫星位点研究仍为空白。因此，为了获得高效的微卫星位点，本研究从基因组出发，进行三带喙库蚊微卫星位点的重新开发。目前，微卫星位点开发的方法有很多，如磁珠富集法和高通量测序法。而相比于高通量测序法，传统的磁珠富集法在兼具准确度高的同时，费用相对低廉且操作简单(Senanetal., 2014)，因此本研究选用该法进行微卫星位点的开发。

多态信息位点值(PIC)最早由Botstein等(1980)提出，用以评估微卫星位点多态性的高低，以确定其是否适用于种群遗传连锁分析。而根据Ditta等(2018)对于PIC值的判定，本研究测试的10个微卫星位点均呈现高度多态性，即PIC>0.50；同时，基于微卫星位点的三带喙库蚊杂合度分析结果也表明：这10个微卫星位点能够准确地分辨种群观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的差异，从而评估三带喙库蚊种群结构受外来选择和近交等因素影响的大小(孙洁茹等, 2011)。因此，本研究开发的三带喙库蚊微卫星位点能够适用于后续三带喙库蚊种群遗传多样性及遗传结构研究。