外源性PPARγ通过上调PTEN表达来达到抑制肺癌细胞增殖的目的

温珊，苏衍萍

（山东第一医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，山东 泰安）

0 引言

根据2017年美国一份关于癌症的报告显示，肺癌仍然是死亡率（男性和女性分别为27%和25%）最高的恶性肿瘤，在我国也有同样的问题，甚至更加严峻。

1 PTEN的分子特质及在肿瘤中发挥的作用

根据研究显示，人第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10,PTEN）,是一种抑癌基因，处于人染色体10q23.3，在细胞增殖方面起着重要的负调控作用，但在肺癌等多种恶性肿瘤中表达比正常组织低。

2 PPARγ的分子特质及在肿瘤中发挥的作用

过氧化物酶体增殖激活受体（PPARγ），人体PPARγ基因位于3p25，全长大于100kb长度。mRNA包括9个外显子，PPARγ最初被发现是脂肪细胞分化、调节脂质代谢、胰岛素敏感性和葡萄糖稳态的转录的重要物质。越来越多的发现PPARγ可以通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及分化、抑制血管形成和降低肿瘤侵袭能力等不同机制发挥着作用，有望成为肿瘤治疗的一个新途径。因此，本研究通过观察PPARγ对人肺腺癌细胞A549相关蛋白的影响，上调抑癌基因PTEN表达的角度探讨PPARγ与肺腺癌的关系。

3 材料和方法

3.1 细胞株与主要试剂

人非小细胞肺癌细胞株（A549）购自上海复祥生物科技有限公司。F-12K Basic 培养基，胎牛血清，含0.25%胰酶-EDTA（Gibco 公司，批号分别为 C11995500CP，1600044，25200072）；磷酸盐缓冲液（PBS，HyClone公司，批号 SH30256.01）；PTEN antibody；PPARγ antibody；mouse antibody；β-肌动蛋白（β-actin）antibody（CST公 司，货 号 分 别 为9188，4257，4366，9268，2118，4790）；鼠抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；发光液（Millipore公司，批号WBKLSO500）；逆转录试剂盒，实时荧光定量PCR（Real-time PCR）试剂盒（罗氏公司，批号分别为04379012001，4913850001）。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成，PTEN上游和下游；PPARγ上游和下游；β-actin 上游和下游 ；E.Z.N.A. Total RNA Kit Ⅱ（OMEGA公司R6934-01）。

3.2 细胞培养

人非小细胞肺癌A549细胞复苏后，用含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的F12K细胞培养液置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养4代后，细胞状态良好，用于实验。

3.3 将目的基因PPARγ和PTEN转染进细胞

收集处于对数生长期的A549细胞，转染前一天，使用胰蛋白酶消化细胞，并进行计数，细胞铺板。使其在转染日密度为90%，细胞铺板中放入含10%血清，不含抗生素的培养液中。对于转染当天，用不含血清的培养基漂洗两次，配好脂质体和质粒轻缓混合，室温放置5分钟，混合稀释的DNA和稀释的3000室温保温20分钟，直接将复合物（100ul）加入到每孔中，在37℃ 5%CO2放置18-48个小时。在细胞中加入复合物18-72小时后，分析细胞的提取物。

3.4 实时荧光定量PCR检测PPARγ和PTEN的表达

取对数生长期的A549，首先用胰蛋白酶消化，再使用预冷的PBS清洗一遍，配RNA与β-巯基乙醇的混合物。混匀吹打，室温孵育，再加入氯仿，之后离心，用试剂盒里面的RNA Wash buffer反复清洗。使用核酸定量仪器测定RNA的浓度和纯度，一般认为，单峰且A260/A280在1.8-2.0，RNA的纯度符合实验要求。根据东洋纺 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover说明书，取总RNA1ug逆转录合成cDNA，以相应的cDNA为模板，加入相应引物，扩增目的基因片段，按照Vazyme的ChamQ SYBR qPCR Master Mix 试剂盒说明书，总反应体系为20ul。按扩增试剂盒参照设置PCR启动程序，95℃激活酶活性10min；95℃变性5s；60℃退火，延伸30s，40个循环，以β-actin为内参，采用2-▲▲Ct计算mRNA相对表达量。

3.5 免疫印迹法检测PPARγ和PTEN的表达

取对数生长期A549细胞以1×105个/孔接种于12孔板，每组设3个复孔。分为四组，空白组：人非小细胞肺癌A549内源性表达；实验组1：将PPARγ转染进细胞并添加其激动剂9-HODE进行检测；实验组2：将PTEN转染进细胞进行检测；实验组3：将PPARγ和PTEN转染进细胞并添加其激动剂进行检测；提取蛋白，置于-20℃冰箱保存。配制12%SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶；用聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，PVDF转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入一抗（抗PPARγ：1：1000；抗PTEN：1：1000；）4℃孵育过夜，滴加二抗37℃孵育1h，洗膜后，按照1：1配制化学发光液，使用化学发光仪器进行曝光成像。

3.6 统计学处理

采用SPSS 22.0进行正态性及方差性检验，所有实验均至少重复3次，计量数据用平均数±标准差表示，当满足正态性及方差性时，采用单因素方差分析；若不满足正态性或方差齐性时，采用秩和检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。P＜0.01为差异显著具有统计学意义。

2 结果

2.1 成功转染基因PPARγ和PTEN

以下是空白组（图A），单独转染PPARγ组并添加其激动剂（图B），单独转染PTEN组（图C），同时将两个基因转染进细胞（图D）。由图一可见，与空白组相比，转染后的细胞没有明显细胞形态的改变或者大量死亡。

图1

2.2 实时荧光定量PCR检测PPARγ和PTEN的表达

结果显示（图2A），qPCR的三组引物（图2B），与对照组相比，选取特异性高的β-actin、PPARγ、PTEN的上下游引物，按照东洋纺qPCR RT说明书操作流程检测PPARγ和PTEN在mRNA水平上的表达。

图2(A)

图2（B）

2.3 免疫印迹法检测PPARγ和PTEN的表达

结果显示（图3），与对照组相比，转染PTEN和PPARγ并激活，显著提高PTEN的表达，其他各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明在蛋白水平上，PPARγ正向调控PTEN的表达。

图3

3 讨论

在当今世界，肺癌是严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤，也是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，是发病率和死亡率最高的肿瘤之一。其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）约占肺癌总数的80%-85%[4,5]，分为鳞癌和腺癌两种亚型。虽然NSCLC在放疗、化疗、手术治疗方面取得了一定临床进展[6,7]，但整体预后较差，5年生存率不足15%[8]。NSCLC发生、发展及预后过程是多个癌基因和抑癌基因共同参与的多步骤、多阶段、多基因改变并且有序的过程。有癌基因的激活、抑癌基因的失活、DNA修复基因的突变、生长因子信号转导通路和细胞周期调节的异常对于肺癌的发生、发展中起着至关重要的作用[9]。

大量前期的研究表明，过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）作为核激素受体PPAR亚家族的成员，包括PPAR-α和PPAR-β。PPAR-γ基因位于3号染色体短臂上，含有9个外显子。PPAR-γ以γ1、γ2和γ3三种亚型存在。在n端有30个额外的氨基酸。在脂肪细胞中单独存在。PPAR-γ最初被认为是脂肪细胞分化、调节脂质代谢、胰岛素敏感性和葡萄糖稳态的转录的重要物质。越来越多的研究发现，PPARγ参与肿瘤的发生发展[1-3]。

目前人类已发现了多种原癌基因和抑癌基因，磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）是继p53后新发现的肿瘤抑癌基因，PTEN基因定位于染色体10q23.3区，全长200kb,由9个外显子和8个内含子组成，mRNA全长5.5kb,其cDNA含有1209个核苷酸组成的开放阅读框架，编码由403个氨基酸组成、分子量为47000的蛋白质。PTEN蛋白中与抑癌功能相关的结构由氨基端（N端）磷酸酯酶结构域、脂质结合的C2结构域和有50个氨基酸残基组成的羧基端（C端）结构域这3个区域共同组成[11]。PTEN被称为继p53时代后突变率最高的“肿瘤抑制基因”，作为到目前为止被发现的第一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN通过诱导细胞分化、凋亡、阻滞细胞周期进程、调节细胞增殖、抑制肿瘤血管生长及细胞的黏附等多种途径发挥其抑制肺癌发生发展的进程，成为肺癌研究的新焦点。

本研究结果显示，虽然，单纯转染PTEN组，可以上调PTEN在蛋白和mRNA的表达，转染了PPARγ并激活组，与单纯转染PTEN组相比较，PTEN在蛋白和mRNA的表达显著升高。说明激活后的PPARγ可以后期实验需要找到基因具体结合的位点，及PPARγ与PTEN之间的相互作用力。下一步可围绕这两点展开深入研究。