G3BP2通过抑制p53/p21信号通路抑制结肠癌细胞衰老

唐 帆，黄永周，庞丽娟，侯吉学

细胞衰老是指在多种内外因素刺激下，细胞内一系列信号通路被激活导致不可逆的细胞周期停滞，其特征主要有染色质改变、细胞代谢及形态的改变以及β-半乳糖苷酶的活性增强[1-2]。p53/p21信号通路是调节细胞衰老的主要机制之一，多种诱导细胞衰老的刺激因子主要通过激活该通路而发挥功能[3]。诱导肿瘤细胞衰老可抑制肿瘤细胞的增殖，激活机体免疫反应，促进衰老的肿瘤细胞及周围正常的肿瘤细胞被清除[4-5]。二磷酸鸟苷(guanosine diphosphate, GTP) 激活蛋白SH3结构域结合蛋白2(RasGAP binding protein 2，G3BP2)是G3BPs家族中的一员，是大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma, Ras) 信号通路的关键调控因子[6]，参与多种细胞内信号传递。另外G3BP2是应激颗粒的重要组成因子，保护其中的RNA不被细胞中的RNA酶所降解[7]，是目前肿瘤领域研究中的重要目标。该研究以结肠癌肿瘤细胞为主要研究对象，初步探讨G3BP2对结肠癌细胞衰老的调控及作用机制，为肿瘤治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂结肠癌细胞LoVo来自于石河子大学医学院第一附属医院病理科实验室。Lipofectamine 2000购于美国Thermo Scientific公司；胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；高糖DMEM培养基购于美国HyClone公司；CCK8试剂购于美国MedChemExpress公司；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；G3BP2抗体购于美国Abcam公司；p53和p21抗体购于美国CST公司；针对G3BP2的siRNA及对照购于广州锐博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 取出冻存于液氮中的LoVo细胞，将其放入37 ℃水浴锅中快速解冻，经1 200 r/min离心后，弃上清液，加入新鲜DMEM高糖培养基(含10% FBS)重悬细胞，将其移至培养瓶中，置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养。

1.2.2真核细胞的转染 将结肠癌细胞种于6孔板中培养过夜；移去上清培养基，换上新鲜无血清DMEM高糖培养基；分别将siRNA及Lipofectamine 2000加入小体积无血清培养基中；将以上转染液轻柔混匀后加入6孔板中；4～6 h后移去转染试剂，加入新鲜完全培养基继续培养48～72 h。

1.2.3CCK8细胞增殖检测 将结肠癌细胞种于96孔板中培养过夜；分别予以不同的转染处理，4～6 h后将转染液换为正常完全培养基；将CCK8稀释成工作浓度，将工作液加入96孔板对应孔中，继续放于培养箱中培养；2～4 h后用酶标仪检测光密度(optical density，OD)490 nm，计算细胞活力。

1.2.4细胞衰老β-半乳糖苷酶染色 将结肠癌细胞种于6孔板中，进行不同转染处理；弃去上清液培养基，加入细胞固定液处理15 min；弃去固定液，经PBS摇洗3次后加入衰老细胞染色液(A液10 μl；B液10 μl；C液930 μl；X-Gal溶液50 μl)；在37 ℃不含CO2条件下孵育过夜，PBS洗2～3次；显微镜下拍照，统计分析。

1.2.5Western blot法 弃去细胞上清液培养基，PBS洗3次；加入RIPA裂解液，放于冰上裂解30 min；在4 ℃条件下，12 000 r/min离心10 min，取上清液；BCA法测蛋白浓度；蛋白上清液加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃煮5 min；蛋白样品经上样、电泳，转至PVDF膜上；5% BSA封闭1 h，4 ℃条件下孵育一抗(G3BP2浓度1 ∶1 000，p53浓度1 ∶1 000，p21浓度1 ∶1 000，GAPDH浓度1 ∶2 000)；室温孵育二抗(G3BP2、p53、p21羊抗兔1 ∶5 000，GAPDH羊抗鼠1 ∶5 000)后，TBST洗2～3次；采用化学发光法检测蛋白表达情况。

1.2.6实时定量PCR 消化离心各组细胞，PBS洗3次；通过TRIzol法提取细胞mRNA；通过两步法将mRNA逆转录成cDNA；将cDNA、引物和TB Green Fast qPCR Mix混合配制成PCR反应液；上机检测后处理数据。

1.3 统计学处理所有实验均重复3次，采用SPSS 23.0软件对实验数据进行分析，所得结果以mean±SD表示。两组间的数据比较采用t检验，多组间的数据比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 G3BP2对结肠癌细胞增殖的影响利用真核细胞转染技术分别将siNC、siG3BP2#1和siG3BP2#2转入LoVo中，72 h后提取蛋白，经Western blot检测各组细胞中G3BP2的表达水平。如图1所示， siG3BP2#1和siG3BP2#2组细胞中G3BP2的蛋白水平明显比siNC组更低，提示G3BP2低表达细胞模型构建成功(图1A)。同样将G3BP2过表达质粒转入结肠癌细胞LoVo中，成功构建G3BP2过表达细胞模型(图1C)。接着将不同组细胞(siNC、siG3BP2#1和siG3BP2#2)种于96孔板中，分别在0、24、48和72 h利用CCK8法检测各组细胞增殖情况，绘制生长曲线，结果显示，与siNC组相比，siG3BP2#1和siG3BP2#2组细胞的生长曲线相对平缓，其细胞生长速度更加缓慢，提示低表达G3BP2可抑制结肠癌细胞的增殖能力(F=14.466,P=0.005)，见图1B。同样利用CCK8检测vector及G3BP2过表达组细胞的增殖情况，结果显示与Vector组相比，过表达G3BP2组细胞生长更快，提示过表达G3BP2可提高结肠癌的增殖能力(F=0.87,P=0.007)，见图1D。

2.2 G3BP2对结肠癌细胞衰老的影响构建G3BP2低表达(siG3BP2#1和siG3BP2#2)LoVo细胞系，因为在正常情况下肿瘤细胞发生衰老的比例较低，因此同时加入多柔比星诱导结肠癌细胞的衰老。多柔比星诱导48 h后，再利用β-半乳糖苷酶染色法对细胞进行染色，显微镜下观察各组细胞中染色情况，并对结果进行统计分析，结果显示：与对照组siNC的染色细胞比例(32±5.10)%相比，siG3BP2#1组比例增加至(57.33±3.68)%(F=0.598,P=0.005)；siG3BP2#2组比例为(56±6.68)%(F=0.276,P=0.016)。说明该组中发生衰老的结肠癌细胞更多(图2A)。这提示低表达G3BP2可诱导结肠癌细胞发生衰老。同样的，对过表达G3BP2及Vector组细胞进行衰老染色，结果显示：过表达G3BP2后，衰老的细胞比例从(35.33±2.87)%降低至(25±2.94)%(F=0.026,P=0.024)，这提示过表达G3BP2可抑制结肠癌细胞衰老(图2B)。

2.3 G3BP2可对p53/p21通路进行调控为明确G3BP2对结肠癌细胞调节的具体机制，笔者提取了siNC、siG3BP2#1和siG3BP2#2组细胞的蛋白，利用Western blot技术检测各组细胞中蛋白表达的变化，结果显示，与对照组相比，低表达G3BP2组细胞中p53及p21的蛋白水平明显增高，这提示低表达G3BP2可激活p53/p21信号通路(图3A)。同样用Western blot检测vector及过表达G3BP2组细胞中的蛋白变化，与上述结果相反，过表达G3BP2可抑制p53及p21的蛋白表达，抑制p53/p21信号通路(图3B)。p53蛋白在细胞内往往受转录后水平调节，为进一步明确G3BP2对p53调节机制，提取各组细胞的mRNA，通过RT-PCR检测其中p53的表达，结果显示，与对照组相比，低表达及过表达G3BP2组细胞中p53 mRNA水平均无明显变化，这提示G3BP2可能通过调节p53的蛋白稳定性抑制p53/p21信号通路(图3C、D)。

图1 G3BP2对结肠癌细胞增殖的影响A：Western blot检测G3BP2基因在结肠癌细胞的敲减效率；B：CCK8法显示低表达G3BP2可抑制结肠癌细胞的增殖能力；与siNC比较：**P<0.01；C：Western blot检测G3BP2的过表达效率；D：CCK8法检测过表达G3BP2可促进结肠癌细胞的增殖能力；与Vector比较：##P<0.01

图2 G3BP2对结肠癌细胞衰老的影响β-半乳糖苷酶染色法×400A：低表达G3BP2可促进结肠癌细胞衰老；与siNC比较：*P<0.05,**P<0.01；B：过表达G3BP2可抑制结肠癌细胞衰老；与Vector比较：#P<0.05

2.4 G3BP2对结肠癌细胞增殖的调节依赖于p53为确认G3BP2通过p53信号通路发挥促进肿瘤生长的功能，将siG3BP2和sip53共同转入结肠癌细胞中，利用CCK8法检测siNC、siG3BP2及siG3BP2+sip53组细胞生长情况，如图4所示，siG3BP2组细胞如预期可抑制结肠癌细胞的生长，而在同时转入sip53后，低表达G3BP2引起的细胞增殖抑制作用被逆转(F=10.193,P=0.012)，见图4A；同样的，在过表达G3BP2细胞中转入p53过表达质粒，利用CCK8法检测各组细胞在不同时间点的细胞活力，结果显示过表达G3BP2可促进结肠癌细胞的增殖，而过表达p53可逆转其促进细胞增殖的作用(F=6.586,P=0.031)，见图4B。上述结果提示，G3BP2对结肠癌细胞增殖的调节主要依赖p53通路。

2.5 G3BP2通过p53抑制结肠癌细胞衰老利用β-半乳糖苷酶染色法检测siNC、siG3BP2及siG3BP2+sip53组细胞衰老水平，如图5所示，与对照组相比，低表达G3BP2后结肠癌细胞衰老比例从(36.00±4.08)%升高至(58.67±4.50)%(F=0.034,P=0.006)，而同时低表达p53后，衰老细胞的比例则降低至(47.00±3.74)%(F=0.034,P=0.006)；同样对Vector、G3BP2和G3BP2+p53组细胞进行衰老染色，结果显示结肠癌细胞在过表达G3BP2后，衰老细胞比例从(38.33±2.62)%降低至(25.67±3.40)%(F=0.319,P=0.014)；而同时过表达G3BP2和p53后，衰老细胞的比例则再次升高至(35.00±1.63)%(F=2.286,P=0.025)。以上结果提示，G3BP2通过p53蛋白实现对结肠癌细胞衰老的调控。

3 讨论

细胞衰老是多种细胞刺激，比如氧化应激、DNA损伤以及某些癌基因的激活等，诱导细胞处于一种不可逆转的细胞周期停止状态[8]。最近文献[9]报道，诱导细胞衰老是抑制癌症发生发展的有效初始屏障。越来越多的数据表明某些治疗性化合物可以诱导衰老，与诱导癌细胞死亡相比，它在抑制肿瘤进展的同时，避免了由正常组织损伤引起的严重副作用。因此诱导肿瘤细胞的衰老是肿瘤治疗中一个很有前景的治疗策略。

图3 G3BP2可对p53/p21通路进行调控A：Western blot检测低表达G3BP2对p53和p21的蛋白水平影响；B：Western blot检测过表达G3BP2对p53和p21蛋白水平的影响；C：RT-PCR检测低表达G3BP2对p53 mRNA水平的影响；D：RT-PCR检测过表达G3BP2对p53 mRNA水平的影响

图4 G3BP2对结肠癌细胞增殖的调节依赖于p53A：CCK8法检测siNC、siG3BP2#1和siG3BP2+sip53组细胞增殖能力变化；与siG3BP2#1比较：*P<0.05；B：CCK8法检测Vector、G3BP2和G3BP2+p53组细胞增殖能力变化；与过表达G3BP2比较：#P<0.05

图5 G3BP2通过p53抑制结肠癌细胞衰老 β-半乳糖苷酶染色法×400A、B： β半乳糖苷酶染色法检测siNC、siG3BP2#1和siG3BP2#1+sip53组衰老细胞的变化；与siNC比较：**P<0.01；与siG3BP2#1比较：#P<0.05；C、D：β半乳糖苷酶染色法检测Vector、G3BP2和G3BP2+p53组衰老细胞的变化；与Vector比较：△P<0.05；与过表达G3BP2比较：▲P<0.05

G3BP2是调节Ras信号通路的关键因子，通过结合在RasGAP蛋白的SH3结构域，激活Ras通路[6]。Ras蛋白的主要下游信号轴有两条：Raf/Erk和PI3K/Akt信号通路。Ras主要通过激活以上两条通路，参与细胞增殖及存活的过程。除此之外，G3BP2在心肌肥厚发生过程中也起着重要作用，它可与IκBα蛋白结合，促进核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)组成成分之一p65的核转运，从而激活NF-κB信号[10]。在肿瘤的发生发展中G3BP2也扮演着关键角色。有文献[6-7]报道，G3BP2在多种人类恶性肿瘤中，比如乳腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤以及肺癌，存在过表达情况，进一步的研究表明，G3BP2参与多种肿瘤发生发展相关的信号通路。基于其在多种生物过程和疾病发病机制(包括肿瘤发生)中的重要参与，G3BP2已成为许多肿瘤学研究中分子研究的目标。本研究显示低表达G3BP2可抑制结肠癌细胞的增殖，而过表达G3BP2则促进结肠癌细胞的生长。进一步研究表明，G3BP2主要通过调控结肠癌细胞的衰老，进而调控其增殖。

p53/p21和p16/Rb通路是调控细胞衰老网络中的关键信号节点，这两条通路的激活是细胞衰老发生的标志[11]。p53是一种重要的抑癌基因，它结合并激活下游靶基因的启动子，促进基因的转录，参与肿瘤的增殖、凋亡及DNA损伤等重要过程，其对细胞衰老的调控主要通过其靶基因p21来完成的[12]。p21是Cip/Kip 家族中的一员，通过抑制CDK家族蛋白的活性，导致细胞周期发生阻滞，直接参与细胞衰老的激活过程[13]。国内外学者已有报道[14-15]，多种途径可对p53进行调节，进而调控肿瘤细胞衰老，具有潜在的临床应用前景。

本实验显示低表达G3BP2可以促进p53及p21的蛋白表达，过表达G3BP2则抑制p53及p21的蛋白表达，通过阻遏实验则验证G3BP2对结肠癌细胞的衰老及增殖的影响主要是依赖于p53通路。进一步的研究表明G3BP2对p53 mRNA水平无明显调节作用，这提示G3BP2可能通过转录后水平调节p53信号通路。G3BP2可激活Ras蛋白，进而激活PI3K/AKT通路。因此笔者推测，G3BP2对p53的调节可能是通过PI3K/AKT通路，尚需要后续实验对其具体机制进行探索。本实验明确了G3BP2对结肠癌细胞衰老调控的作用及可能机制，为以诱导肿瘤细胞衰老为目的的肿瘤治疗策略提供了可能的靶点及线索。