RNAi技术敲减乳腺癌MDA-MB-231细胞SIRT2基因的研究

张 舟，邓小冲，章 骏，夏振华，房 林

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，对女性健康构成了巨大威胁[1]。根据激素受体的表达情况，可将乳腺癌分为Luminal A型、Luminal B型、人表皮生长因子受体2过表达型以及三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌是侵袭性强的一种乳腺癌亚型，雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor, HER2)的表达均为阴性，目前尚缺乏明确有效的治疗靶点[2]。临床上针对三阴性乳腺癌的治疗以化疗为主，但有效率偏低，治疗后复发风险高[3]，因此研究三阴性乳腺癌可能的分子标记物及治疗靶点显得格外重要。沉默信息调节因子(silence information regulator，sirtuin)是一个高度保守的基因亚家族，能编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的组蛋白去乙酰化酶，在细胞衰老、代谢、凋亡、基因转录、炎症发生等过程中起着重要作用[4-7]。该基因家族中的SIRT2 的异常表达与肿瘤发生发展的关系比较复杂，以SIRT2为靶点的抗肿瘤治疗一直是一个有争议的话题。SIRT2在乳腺癌的发生发展过程中究竟起着抑癌作用还是促癌作用，不同的研究结论并不完全一致[8]。有研究者[9-10]开发了一种SIRT2特异性抑制剂，在乳腺癌小鼠模型中显示出了抗癌作用，而另一项研究[11]则表明缺乏SIRT2的雌性小鼠发生乳腺肿瘤的可能性明显增加。

鉴于目前出现的矛盾的研究结果，现通过小RNA干扰技术(siRNA)敲减三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的SIRT2基因，探究下调SIRT2的表达对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞购自中国科学院细胞库；总RNA提取试剂、胎牛血清(FBS)和DMEM培养基购自美国ThermoFisher 公司；Hieff TransTMLiposomal Transfection Reagent，RT-PCR试剂盒Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox Plus)购自上海翊圣生物科技有限公司；逆转录试剂HiScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；SIRT2引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；SIRT2-siRNA和siRNA 阴性对照序列由艾博思生物科技有限公司(上海)合成；MTT试剂盒从碧云天生物技术有限公司(上海)购买。

1.2 方法

1.2.1细胞复苏与培养 MDA-MB-231 细胞冻存于液氮中，取出后迅速在37 ℃条件下复苏、离心、重悬细胞，用含10% FBS和1% PS(链霉素、青霉素)的新鲜DMEM培养基于5% CO2、37 ℃ 培养箱中培养。

1.2.2铺板与转染 细胞生长处于对数期时进行铺板；胰酶消化细胞，贴壁的MDA-MB-231细胞快分散成单个细胞时加入足量的完全培养基终止消化；800 r/min离心5 min,弃上清液，培养基重悬细胞，然后用全自动细胞计数仪计数，以1×105/cm2的密度铺板。铺板20～24 h后使用阳离子脂质体法进行转染，根据Hieff TransTMLiposomal Transfection Reagent操作说明进行转染。阴性对照(negative control, NC)组转染SIRT2-siRNA NC序列；实验组转染SIRT2-siRNA序列(检测转染效率时两条干扰序列分开转染，做功能实验时将SIRT2-siRNA 1序列与SIRT2-siRNA 2序列混合转染)；设置 3重复。转染后于5% CO2、37 ℃培养箱中培养 6 h后换液。

1.2.3转染效率检测 培养48 h后采用RT-PCR法(实时荧光定量PCR法)检测转染效率。根据TRIzol试剂使用说明提取细胞总RNA，提取RNA后使用逆转录试剂盒HiScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)逆转录得到cDNA，使用SIRT2引物进行RT-PCR，以ACTIN为内参，根据PCR结果，使用2-ΔΔCT法计算转染效率。

1.2.4细胞增殖能力检测 将NC组和实验组MDA-MB-231细胞分别以2 000个/孔的密度接种至 96 孔板， 设置6个复孔，根据 MTT试剂盒说明，分别于0、24、48、和72 h检测吸光度(optical density, OD)(490 nm)，根据吸光度的结果绘制生长曲线。

1.2.5克隆形成能力检测 将NC组与实验组MDA-MB-231细胞分别以100个/孔的密度接种至12孔板，设置3重复，充分摇晃使细胞分散均匀，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，观察到有明显的细胞克隆形成时，弃去培养基，无水乙醇固定，0.1%结晶紫染色，统计每孔形成的克隆数，计算两组MDA-MB-231细胞的克隆形成率。克隆形成率 =(形成的克隆数 / 100)×100%。

1.2.6迁移能力检测 预先在6孔板底部沿长轴画2条标记线，遵循转染的步骤进行转染，设置2个复孔，细胞密度达95%时用200 μl型号的枪头垂直于标记线在细胞上划痕，PBS洗3次，每孔加入2 ml含2% FBS的DMEM培养基，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。按照0、24、48 h时间点选取同一视野进行拍照。使用Image J图像处理软件分析划痕结果，计算迁移率。迁移率=0 h伤痕面积/24 h伤痕面积。

2 结果

2.1 转染效率检测实验组MDA-MB-231细胞SIRT2 mRNA表达水平低于NC组(P<0.01)。见表1、图1。

表1 转染SIRT2-siRNA后SIRT2 mRNA的相对表达情况

与NC组比较：*P<0.01

图1 转染SIRT2-siRNA对MDA-MB-231细胞SIRT2 mRNA表达的影响A：qRT-PCR扩增曲线；B：MDA-MB-231细胞转染SIRT2-siRNA后SIRT2 mRNA的表达；1：NC组；2：SIRT2-siRNA1组；3：SIRT2-siRNA2组；与NC组比较：*P<0.05

2.2 敲减SIRT2抑制MDA-MB-231细胞的增殖实验组MDA-MB-231细胞增殖能力低于NC组(P<0.05)。见表2、图2。

2.3 敲减SIRT2抑制MDA-MB-231细胞克隆形成实验组MDA-MB-231细胞克隆形成率低于NC组(P<0.01)。见表3、图3。

时间点(d)NC组实验组P值F值00.104±0.0007300.0995±0.0010610.185±0.008810.159±0.006900.03941.6320.399±0.01310.331±0.007640.00132.9330.725±0.02650.586±0.013600.00093.79

P值表示与NC组比较

图2 敲减SIRT2对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响与NC组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表3 敲减SIRT2对MDA-MB-231细胞克隆形成的影响

2.4 敲减SIRT2抑制MDA-MB-231细胞的迁移实验组MDA-MB-231细胞迁移能力低于NC组(P<0.05)。见表4、图4。

图3 敲减SIRT2对MDA-MB-231细胞克隆形成的影响

组别迁移率P值F值NC1.57±0.04500.02181.65实验1.19±0.0350

3 讨论

乳腺癌是女性较为常见的恶性肿瘤，影响着广大女性群体的身心健康，与发达国家相比，我国乳腺癌的发病率总体上处于较低的水平，但近年来乳腺的发病率逐年升高[12]。临床上根据ER、PR、HER2和Ki67的表达的情况，将乳腺癌分为4种不同的亚型，针对不同的亚型，在手术之外分别辅以内分泌治疗、靶向治疗和化疗。三阴性乳腺癌是侵袭性较强的恶性肿瘤，化疗有效率低，化疗后复发风险高，目前三阴性乳腺癌尚缺乏特异的分子标志物可以作为治疗靶点[3]，所以研究三阴性乳腺癌潜在的分子标志物尤为重要。MDA-MB-231是较为常用的三阴性乳腺癌细胞系，其ER、PR、HER2的表达均为阴性，具有很强的侵袭能力。本研究通过RNAi技术敲减感兴趣的基因，通过MTT实验，平板克隆形成实验以及划痕实验来探究目的基因敲减后对细胞增殖能力、克隆形成能力和迁移能力的影响，从而验证目的基因在肿瘤发生发展过程中的作用。

图4 敲减SIRT2对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 ×100

SIRT2是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的组蛋白去乙酰化酶，与肿瘤的发生发展有一定相关性。一项回顾性研究[13]分析了296例原发性乳腺癌手术切除患者的临床资料，采用免疫组化检测肿瘤及癌旁组织中SIRT2的表达，发现肿瘤组织中SIRT2的表达较邻近组织低，肿瘤组织中SIRT2的高表达与乳腺癌患者T期降低、N期减少、TNM期减少、OS期延长有关。同样，Fiskus et al[14]研究认为SIRT2能够限制过氧化物氧化还原蛋白1的抗氧化活性，从而使乳腺癌细胞对活性氧诱导的DNA损伤和细胞毒性敏感从而发挥抑癌作用。与此相反，另一项研究[15]的结果则表明SIRT2在基底样乳腺癌中经常被扩增和高表达，就具体作用机制而言，SIRT2在赖氨酸残基K116处去乙酰化Slug蛋白，防止了Slug蛋白的降解。而Slug蛋白的过表达是基底样乳腺癌侵袭性的一个重要决定因素，Slug的累积促进了乳腺癌的发生发展。另外，Jing et al[9]开发了一种有效的SIRT2特异性抑制剂，在乳腺癌小鼠模型中表现出了抗癌作用。这些矛盾的研究结论表明SIRT2在乳腺癌中存在着的复杂作用，同时也表明乳腺癌是一类异质性较为明显的恶性肿瘤。

本研究通过RNAi技术，初步探讨了SIRT2在三阴性乳腺癌中作用。在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中转染SIRT2-siRNA后，通过MTT比色法检测MDA-MB-231的增殖情况，显示与阴性对照组相比，转染SIRT2-siRNA后MDA-MB-231细胞的增殖能力明显受到抑制；平板克隆形成实验的结果也表明敲减SIRT2的表达后细胞的克隆形成能力受到抑制。除了研究SIRT2对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响，课题组也研究了SIRT2对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响，细胞划痕实验的结果表明SIRT2受抑制后，MDA-MB-231细胞迁移能力也下降了。综上所述，本研究初步表明SIRT2在MDA-MB-231细胞中表现出了促癌作用，后续需要进一步的研究探讨SIRT2具体的分子生物学机制。