利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠ERp46蛋白和脂联素及氧化应激的影响

王爱芳，钟 兴，潘天荣

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是目前常见的肝脏慢性疾病，如今在饮食、环境等因素的影响下，其发病年龄呈年轻化趋势，可发展成为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等疾病。ERp46为内质网蛋白之一，ERp46 mRNA和蛋白在肝组织中高度表达，与蛋白质二硫键异构酶 (protein disulphide isomerase,PDI)有关，在细胞内可能起到分子伴侣的作用，可促进蛋白折叠和二硫键形成[1]。目前推测它可能具有多种生物学功能。胰高血糖素样肽1 (glucagon-likepeptide 1，GLP-1) 类似物利拉鲁肽 (liraglutide) 具有抗炎及改善糖脂质代谢紊乱等作用[2]。近年来，各种研究不断拓展它除降糖减重以外的临床应用范围。现利用高脂饮食诱导的NAFLD大鼠，观察利拉鲁肽对NAFLD大鼠肝组织ERp46表达的影响，旨在初步探讨利拉鲁肽改善NAFLD 的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠共32只，体质量(180±10)g，每标准鼠笼4～5只，室内温度20～25 ℃，明暗各12 h，购自安徽省实验动物中心。

1.2 实验材料利拉鲁肽：诺和诺德公司(批号：DP51077)；超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、丙二醛 (malonaldehyde,MDA)、游离脂肪酸 (free fatty acids, FFA)检测试剂盒(南京建成生物技术有限公司)；脂联素 (adiponectin, ADP)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor, TNF-α)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗ERp46(美国 Santa Cruz Biotechnology 公司)；兔抗GAPDH、羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1模型建立及处理 32只大鼠随机分成高脂组20只及正常对照组12只，分别予高脂饲料及普通饲料喂养(高脂饲料配方：基础饲料81.8%+胆固醇2%+猪油6%+蛋黄粉10%+胆盐0.2%)。12周末，从高脂组和正常对照组中随机各选2只大鼠处死，肝组织病理提示NAFLD模型成功，再将高脂组随机分为利拉鲁肽组9只和安慰剂组9只，2组继续予高脂饮食，每日分别予皮下注射利拉鲁肽0.6 mg/kg[3]和等体积的生理盐水，对照组继续普通饲料喂养；期间自由进食水；28周末处死各组大鼠。

1.3.2标本采集及10%肝匀浆制备 28周末，称取各组大鼠体质量，麻醉后取血，分离血清，分装并贮存备用，后取肝脏称重，计算肝指数[肝指数(%)=肝重/大鼠体质量×100%]；称取肝组织100 mg，剪碎置于研磨器中，按比例加入匀浆介质(m:v=1 g:9 ml)，充分匀浆，3 000 r/min离心10 min，上清液即为10%肝匀浆。

1.3.3血清空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、空腹胰岛素(fasting insulin, FINS)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、甘油三酯(triglyceride, TG)、胆固醇(cholesterol, CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein, HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein, LDL-c )、ADP及肝匀浆TG、CHO、游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)、MDA、TNF-α、SOD、ADP指标测定 生化分析仪检测FBG、FINS、ALT、TG、CHO、HDL-c、LDL-c；分光光度计检测FFA，酶联免疫吸附法测定ADP、SOD、TNF-α、MDA的含量；生物化学法检测肝组织TG、CHO；计算胰岛素抵抗指数(homeostasis assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5。

1.3.4肝组织HE染色 剪取相同部位肝组织块，固定后脱水、石蜡包埋、冰冻切片、HE染色，再置于光镜下观察，毎张切片观察5个视野。

1.3.5实时PCR检测肝组织ERp46 mRNA表达 称取50 mg肝组织，提取并纯化总RNA，多功能酶标仪测定RNA样本浓度并稀释至500 ng/μl，然后进行逆转录和扩增。以GAPDH进行标准化，制成标准曲线；反应结束后分析产物溶解曲线，再运用2-△△Ct法分析数据。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。GAPDH上游引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′；下游引物5′-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3′；ERp46上游引物5′-CAGACGTCACCATCGCAGAA-3′；下游引物5′-GCGCAGAACAAAGCTGTGTAGA-3′。

1.3.6Western blot检测肝组织ERp46蛋白表达 称取相同部位肝组织100 mg，置于研磨器中，充分剪碎，按比例加入PMSF细胞裂解液(100 mg ∶1 000 μl)，充分匀浆，12 000 r/min离心10 min，BCA法测定总蛋白浓度。 取含总蛋白约50 μg的样品进行SDS-PAGE电泳，转膜后封闭2 h，然后分别加入兔抗ERp46(1 ∶1 000)及兔抗GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜，洗膜后加入抗兔IgG(1 ∶5 000)，于室温摇床孵育2 h，洗膜后显影，Western自动曝光机曝光，用Image J软件分析蛋白条带。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、肝指数及血清指标变化3组大鼠FBG、HDL差异无统计学意义；安慰剂组大鼠体质量、肝指数、HOMA-IR、FINS、ALT、TG、CHO、LDL-c较正常对照组均升高(P<0.01),大鼠血清ADP较正常对照组降低(P<0.01)；利拉鲁肽干预16周后，大鼠体质量、肝指数、HOMA-IR、FINS、ALT、TG、CHO、LDL-c较安慰剂组下降(P<0.01)，血清ADP较安慰剂组升高(P<0.01)；利拉鲁肽组与正常对照组大鼠体质量、肝指数、HOMA-IR、FINS、ALT、TG、CHO、LDL、ADP差异无统计学意义。见表1。

2.2 各组大鼠肝匀浆指标变化安慰剂组大鼠肝匀浆TG、CHO、FFA、MDA、TNF-α较正常对照组均增高(P<0.01)，ADP、SOD降低(P<0.01)；利拉鲁肽组TG、CHO、FFA、MDA、TNF-α较安慰剂组均下降(P<0.01)，ADP、SOD 升高(P<0.01)；利拉鲁肽组与正常对照组TG、CHO、FFA、MDA、TNF-α、ADP、SOD差异无统计学意义。见表2。

2.3 各组大鼠肝组织病理学变化正常对照组：肝小叶结构正常，肝细胞索正常，肝细胞未见气球样变性；安慰剂组：肝小叶结构及肝细胞索紊乱，肝细胞见大泡样脂肪空泡变性，细胞核部分被挤压变形，少部分消失，肝窦狭窄或消失，炎性细胞浸润；利拉鲁肽组：肝小叶结构及绝大部分肝细胞基本正常，可见极少量肝细胞脂肪空泡变性，细胞核被挤压变形，见图1。

2.4 肝组织ERp46 mRNA及蛋白的表达与正常对照组相比，安慰剂组大鼠肝组织ERp46 mRNA及蛋白表达降低(P<0.01，P<0.05)，而利拉鲁肽组ERp46 mRNA及蛋白水平较安慰剂组升高(P<0. 01),见图2。

表1 各组大鼠体质量、肝指数及血清指标变化

与正常对照组比较：**P<0.01；与安慰剂组比较：##P<0.01

表2 各组大鼠肝匀浆指标变化

与正常对照组比较：**P<0.01；与安慰剂组比较：##P<0.01

图1 各组大鼠肝组织病理学变化 HE×200A：正常对照组；B：安慰剂组；C：利拉鲁肽组

图2 利拉鲁肽对大鼠肝组织ERp46 mRNA及蛋白表达影响A：各组大鼠肝脏 ERp46 mRNA表达水平；B： 各组大鼠肝脏 ERp46 蛋白表达水平；C:正常对照组；P：安慰剂组；L：利拉鲁肽组；与正常对照组比较： *P<0.05，**P<0.01；与安慰剂组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.5 肝组织ERp46表达水平与ADP及氧化应激指标的相关性分析肝组织ERp46表达与血清及肝匀浆ADP水平呈正相关(r1=0.877,P<0.01；r2=0.911,P<0.01)，与SOD水平呈正相关(r=0.860,P<0.01)，与MDA、FFA及TNF-α均呈负相关(r1=-0.908,P<0.01；r2=-0.921,P<0.01；r3=-0.857,P<0.01)。

3 讨论

GLP-1是肠促胰岛素中有重要生理功能的一种肽类激素，具有降糖、调脂、减重、影响胰岛素信号转导通路等作用。利拉鲁肽是GLP-1类似物，与天然GLP-1拥有97%的同源性，因而具备GLP-1全部生理作用。研究[2]表明，GLP-1受体激动剂可改善肝脏的脂肪变性及氧化应激，对NAFLD起到显著改善作用。本研究中，安慰剂组大鼠体质量、肝指数、HOMA-IR、血清TG、CHO、LDL、ALT及肝匀浆TG、CHO、FFA均增高，利拉鲁肽干预后，NAFLD大鼠脂质代谢紊乱减轻，且与对照组差异无统计学意义，表明利拉鲁肽具有降脂、减重，改善胰岛素抵抗作用，与文献[2-3]研究结果一致。

SOD是重要的抗氧化物酶，为清除体内自由基的首要物质。MDA为脂质的一种氧化终产物。SOD和MDA可联合用来评价细胞的氧化应激水平[4]。TNF-α是重要的促炎症因子，TNF-α水平升高是NAFLD发生发展的独立危险因素。利拉鲁肽能减轻TNF-α诱导的人内皮细胞氧化应激和炎症反应[5]。本研究中，安慰剂组SOD下降，MDA和TNF-α升高，而利拉鲁肽组SOD升高，MDA和TNF-α下降，细胞损害减轻，且与对照组差异无统计学意义，表明利拉鲁肽能明显改善NAFLD氧化应激及脂质过氧化。

ADP是由成熟脂肪细胞分泌，有多种生物学作用的特异性蛋白。研究[6]显示，ADP水平与肥胖、胰岛素抵抗、冠心病及NAFLD密切相关，具有改善糖脂代谢及抗炎等作用。GLP-1受体激动剂能显著提高NAFLD小鼠血清ADP水平，逆转肝脏脂肪变性或改善胰岛素抵抗[7]。本研究中，安慰剂组ADP水平降低，利拉鲁肽组血清和肝脏中ADP水平均升高，与对照组相比差异无统计学意义，说明ADP可能参与了利拉鲁肽的抗氧化和抗炎作用。

ERp46是内质网PDI家族成员之一，能促进蛋白质折叠和二硫键的形成，在肝细胞、浆细胞及内皮细胞等表达较高。研究[8]表明，利拉鲁肽能够上调糖尿病大鼠胰岛中ERp46 mRNA及蛋白的表达，可与ADP受体结合，调控ADP信号通路转导，在糖尿病和胰岛素抵抗的发病中发挥重要的作用[9]。另外，ERp46又可抑制内质网应激[10]。在肝组织中，利拉鲁肽可通过抑制肝内质网应激改善胰岛素抵抗，减轻NAFLD大鼠氧化应激损伤[11-12]。本研究中安慰剂组大鼠，肝组织ERp46表达均下降，利拉鲁肽组ERp46的表达上调，与对照组差异无统计学意义，同时肝组织ERp46表达与ADP及SOD水平呈正相关，与MDA、FFA及TNF-α呈负相关，因此，利拉鲁肽改善NAFLD的另一机制可能是通过上调肝组织ERp46表达和脂联素水平，改善内质网应激，减轻氧化应激损伤，保护肝细胞。其中ERp46蛋白表达的下调机制仍有待进一步研究。

综上，利拉鲁肽改善NAFLD的作用可能与上调ERp46蛋白表达和脂联素水平，改善内质网应激，减轻氧化应激损伤密切相关。