三叶草属牧草育种研究进展

郭 月,石凤翎,王明玖,刘嘉伟，倪鹏程，曹克璠

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，草地资源教育部重点实验室，农业农村部饲草栽培加工高效利用重点实验室，内蒙古自治区草地管理与利用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010019)

三叶草属(Trifolium)，也称车轴草属，一年生或多年生草本植物，在全世界温带地区广泛分布，尤其以非洲南部、南美的温带分布较多〔1〕。三叶草属约有360多个种，大多数为野生种。在农业生产中利用价值较高的约有25种，其中最重要且分布较多的是以红三叶(TrifoliumpratenseL.)、白三叶(TrifoliumrepensL.)和杂三叶(TrifoliumhybridumL.)为主〔2-5〕。三叶草对食草家畜具有良好的适口性、丰富的可利用碳水化合物及蛋白质，被世界多地用作反刍动物的饲料。同时还被广泛地用于草坪地被和水土保持，其与禾本科牧草进行混播时生长能力良好，这对草地生态系统的稳定发展起到重要作用。目前从国外引种栽培的三叶草属牧草占全国三叶草属种植资源的大部分，约有11种，产于国内的三叶草属种类并不多，目前已知的仅有4种，即白三叶、红三叶、草莓三叶草(TrifoliumfragiferumL.)和野火球(TrifoliumlupinasterL.)〔6〕。

白三叶含有多种营养物质和矿物质成分，有较高的饲用、绿化、遗传育种和药用价值，具有抗寒、耐旱、耐践踏、抗杂草等优良特性，对于牧草品种改良和新品种的选育具有极其重要的意义〔7〕。红三叶产量高、营养价值高、耐刈性强等。在人工混播草地中，红三叶是禾木科牧草的最理想伴生种，已被大范围栽培种植〔8〕。红三叶的形态发育，与生物量的形成和营养物质的积累密不可分，直立性、株高、分枝数、生长速度、刈割及栽培措施等都是构成红三叶产量的重要因子。Rumbaugh〔9〕研究表明，丛径、茎长和分枝数都是影响牧草产量的关键因素，并且其与产量极显著正相关，其中分枝数对产量的影响最大。Jones〔10〕指出，植株的分枝速率或分枝密度是影响草产量高低的一个重要因素，故选择产量时可以以牧草的形态特征为依据。

高加索三叶草(TrifoliumambiguumBieb.)忍耐水淹的能力远高于苜蓿。研究表明，一些能忍受积水和表面流水的高加索三叶草品系，在淹水深达15cm的40d 后，其田间存活率超过80%。由于该物种具有较深的根和发达的根蘖，水土保持的能力是很强的。它对磷供应的依赖程度较低，所以对于不肥沃的受到侵蚀的地区植被恢复具有潜在的价值〔11〕。在生产应用方面，国外大量的研究表明，高加索三叶草同其他三叶草属牧草相比，有较低的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和较高的体外干物质消化率。研究证实高加索三叶草能够产生高质量牧草，并且提供较好的蛋白质组成〔12〕，这对提高混播草地的产量、质量以及季节分配起到十分重要的作用。

蒙农三叶草1号(TrifoliumambiguumBieb. Cv.Mengnong No.1)是内蒙古农业大学利用高加索三叶草多年选育而成的新品种，于2011年12月通过内蒙古自治区草品种审定委员会审定注册。该三叶草能够在内蒙古多数地区越冬，抗旱能力强，适于栽培。本文简要总结了国内外三叶草属牧草育种的概况，以期对今后三叶草属牧草的育种改良研究提供借鉴作用。

1 国外三叶草属牧草育种研究进展

三叶草的育种工作开始于20世纪20年代初。1920年由荷兰首先培育出Dutch白三叶品种。1927年，丹麦选育出Morsootofee白三叶。进入20世纪40年代，荷兰、英国、芬兰、瑞典、法国等国家先后选育出Fres、Perina、Tammninges、Louisiana、Kenland等数十个白三叶和红三叶品种，这些品种大部分是通过自然选择法选育出的适应当地气候条件的生态型，或是通过混合法选育出的比当地生态型优良的品种〔2〕。国外多数研究〔13〕将三叶草生长的持久性(即单株寿命)作为其育种计划的研究重点，其寿命的长短可直接影响牧草的适应性和产量。为了提高持久性，一般都增强抗病虫害能力，还有就是改变其形态特征，如白三叶的生育期、耐牧型和匍匐茎等。

红三叶(T.pratensL.)是世界温带地区的重要牧草，可单独生长或与杂草混合生长，适应各种类型的土壤环境〔14〕。1989年智利的一个研究中心启动了红三叶育种计划，其主要目标是提高植物的存活率、饲草产量和持久性。因为基因型与环境的生物和非生物因素相互作用可以影响植物的长期表现型，所以红三叶的育种计划需要考虑环境和管理的双重因素。Ortega研究了不同环境对植物形态、植物存活率(植物死亡率)和牧草产量的影响。研究发现，红三叶在间隔植物的环境下生存与不经常切割的草地之间存在显著的相关性〔14〕。

红三叶是一种天然的二倍体植物，但含有大量合成的同源四倍体培育品种。红三叶与相关物种之间的系统发育关系并不像白三叶那样明确〔15〕。栽培的红三叶可以根据染色体倍性水平和开花早期进行分类〔16〕。四倍体品种相对于二倍体表现出较低的可育性(种子形成)，可能是由于多倍体形成和授粉减少。由于红三叶的栽培历史较长，且栽培品种与野生(自然)形态品种的分化较强，因此，地方品种在红三叶育种过程中的作用比白三叶育种中的作用更为突出。与白三叶一样，虽然红三叶与相关物种之间的种间杂交强度较低，但Abberton〔17〕已开展了几个种间杂交计划。主要的经验是通过与更持久的三叶草物种杂交来增加寿命，特别是中间车轴草(TrifoliummediumL.)，该物种以染色体数目为2n=48～126的多倍体系列出现〔18〕。然而，这些杂交结果至今没有明显的经济影响〔19〕。

国外研究在三叶草抗病品种方面较为深入，目前已研究出抗炭疱病、腐烂病、白粉病、叶斑病和根结线虫等多个三叶草品种〔20,21〕。研究者普遍认为利用遗传效应和大田连续选择是提高三叶草抗病害能力较有效的方法。关于红三叶形态特征育种方面，一些研究表明为增加茎长，多次经过周期选择大大增加株高。结果发现株高明显增高，但茎的数量有所下降，植物的单个花序数增多，而单株的花序数却明显下降。红三叶轮回选择效力和遗传可塑性再次证明，在不产生其他不受欢迎的形态特征前提下，改变它的某个形态是极其困难的〔13〕。

研究推断地中海东部地区是白三叶和红三叶的起源中心，而最初发现的白三叶很可能是品种间长期杂交而成〔16〕。这些三叶草存在一年生和多年生的品种，其物种的多样性为基因组的阐明和改良提供了潜在的遗传资源〔18,22〕。白三叶原产于欧洲、欧亚大陆、中东和北非，并在世界许多国家作为一种栽培品种引入。T.occidentale是二倍体(2n=2x=16)多年生品种，被认为可能是白三叶的祖先二倍体亲本〔16〕，而另一个二倍体亲本被推测为T.nigrescens或T.pallescens，但尚未得到证实。T. occidentale也正在被作为一种模式品种，用来开发与白三叶复合体相关的遗传和基因组研究〔23〕。

三叶草的遗传资源，以及它们在红三叶、白三叶和其他三叶草物种的植物育种中的应用是近年来热点的研究〔15,24,25〕。白三叶在种群间表现出相当大的适应性变异〔26〕，以及高水平的表型可塑性和种群内变异。种群内变异比牧草产量及其成分的种群间差异大2到5倍，而种子产量组成部分的差异则更大，这些物种在起源地被收集和评估〔27〕。缺乏遗传变异本身并不是白三叶育种中的主要问题〔25〕，利用异地遗传资源是开发新品种的关键。许多国家都有收集大量的生态类型，为直接开发提供了一系列不同叶片大小的适应植物类型，或作为与Ladino类型杂交的材料。传统上，植物育种者通过收集探索获得新的植物材料，找到可能发现所需性状的地理区域〔17〕。植物育种者也使用基因库收集作为遗传物质的来源，欧洲中央白三叶数据库(www.ecpgr.cgiar.org)中就包含了存储在14个欧洲基因库中的白三叶的基本资料，以及访问欧洲以外其他基因库和收藏的门户〔25〕。

关于白三叶，Williams已经开展了几个主要项目〔28〕，在新西兰和英国，旨在将重要的特性引入白三叶。已将白三叶与二倍体一年生植物T.nigrescens(2n=2x=16)进行了杂交，这是一种与白三叶相比种子产量高，具有良好的线虫抗性，开花丰富的植物〔29〕。将四倍体T.ambiguum材料的根茎性状导入白三叶内，与白三叶亲本和对照品种作对比，选育出抗旱性显著提高的新品系，并改善了饲草品质特性〔30-32〕。同时，进行了白三叶和T.uniflorum之间的种间杂种用于改善耐旱性的潜力〔28〕。还有报道表明，白三叶在与高加索三叶草(T.ambiguumBieb.)的可育回交中显示出了不同的倍性水平〔33〕。近年来，白三叶的突变二倍体祖先品种之间的种间杂交已经被用来创造对植物育种有价值的独特新种群〔33〕。

高加索三叶草(T.ambiguumBieb.)是可以利用根蘖进行强克隆繁殖的多年生三叶草属牧草，也是一种具有水土保持能力的植物〔12〕，原生在寒冷的高加索山地，在高寒草甸及相对干旱的低海拔禾草草原、土耳其东部和伊朗北部地区生长〔34〕。高加索三叶草根系发达，主根入土较深，且具有极强的抗逆性。高加索三叶草种子硬实率高，新收获的二倍体Summit种子发芽率很低〔11〕。通过了解播种当年高加索三叶草的发育状况，发现不同播种时期高加索三叶草的生长状况以及地上地下生物量积累有着显著差异。美国春季播种的高加索三叶草约在56d后可观测到粉红色的小节，播种后63d出现长度小于或等于3cm的根蘖。夏季播种后42d可观测到粉红色小节，100d后出现长度小于3cm根蘖。春季播种的根蘖占地下生物量的10%左右，尽管播种当年地上地下干物质量很低，但通过选择高的生物量来提高种苗活力是十分有效的〔35〕。高加索三叶草的另一缺陷是在自然状况下不能形成根瘤进行生物固氮。只有通过专一根瘤菌接种剂接种才能形成根瘤，或通过和白三叶杂交育种后才能固氮〔36〕，也可与白三叶或豆科牧草混播进行氮替换。澳大利亚相关研究人员在高加索三叶草引种过程中发现，结瘤能力差是高加索三叶草不能固氮的主要问题之一〔37〕。

2 国内三叶草属牧草育种研究进展

我国传统畜牧业集中分布在寒冷干旱的北方地区，不适宜三叶草的建植与推广，所以三叶草的育种工作开展较晚。随着南方的草地畜牧业兴起，及其在人工草地建植中的重要作用。20世纪80年代后，三叶草育种工作逐步开展。初期的主要工作是引入国外优良品种、对地方品种进行整理，以及野生三叶草的驯化等。如已登记注册的地方品种有岷山红三叶、巴东红三叶、天水红三叶、贵州白三叶、巫溪红三叶和蒙农三叶草1号等；野生驯化的有延边野火球；从国外引进的优良品种有Huiz和Ladino白三叶，高加索三叶草等，还培育了鄂牧1号、胡依呵、川引拉丁诺等品种〔6〕。

1992年安利佳等人〔38〕对白三叶愈伤组织的诱导和植株再生的方法和技术进行了探索。周建明〔39〕对白三叶成熟胚的再生不定芽进行了研究，发现在低浓度的植物生长素和高浓度的细胞分裂素条件下，白三叶的不定芽可以再生。同年，继续对白三叶细胞悬浮培养物诱导不定芽，用来自白三叶未成熟胚的愈伤组织成功建立了细胞悬浮培养系。而后，又利用白三叶的悬浮细胞系进行农杆菌介导的转基因研究，得到了载有外源基因的不定芽〔40〕，该研究为白三叶细胞悬浮培养物诱导不定芽的形成提供了理论依据。1994年，孟玉玲在MS培养基上利用红三叶的下胚轴再生植株，得到再生率为27%的再生苗；用子叶在B5加6-BA0.1mg·L-1和IBA0.2mg·L-1的培养基上诱导愈伤得到分化率为5～10%的再生植株〔41〕，为下一步更好的进行继代提供了可靠的依据。黄红等人〔42〕用红三叶和白三叶的叶片作为外植体，筛选出了最佳的胚性愈伤组织诱导培养基，得到胚性细胞悬浮系。张德炎等人〔43〕也曾建立了白三叶的胚性细胞悬浮系，最终试验发现缩短换液的时间(每隔3～4d换液一次)可加快胚性细胞悬浮系的建立。杨丽莉等人〔44〕利用白三叶子叶和下胚轴为外植体进行直接再生，最终发现下胚轴的分化率高于子叶，达到65%以上，这表明高分化率的下胚轴更适合做三叶草直接再生的外植体。

3 三叶草属牧草常规育种方法及进展

3.1 引种驯化

我国从19世纪末开始从欧美等国家引种三叶草，经过适应性试验和长期的选择，有些品种已经成为引种地区的主要牧草品种。1875年我国自比利时引进巴东红三叶，在湖北省鄂西地区经多年栽培，驯化而成地方品种。岷山红三叶是岷山种畜场从美国引进的红三叶逸散种中整理而成。1953年，四川省巫溪县红池坝农场的技术员从美国友人处获得几粒巫溪红三叶种子，后在巫溪红池坝种植。34年后在红池坝采集到部分种子，并在当地播种，后经整理而成。我国野生白三叶主要分布在新疆大山北麓湿润的河滩草地。在吉林省海拔50m的珲春县的低湿草地集中分布。黑龙江尚志县、内蒙古呼伦贝尔市及贵州、湖北、四川、湖南、山西、陕西等省区均分布着野生白三叶。研究表明，这些野生类型大都属于小叶型三叶草，不足的是早熟、产量低、不抗病及抗热性较差。但经过了长期的自然选择，形成了适应于各地自然条件的生态类型，也是选育新品种的宝贵资源。我国的延边野火球和贵州白三叶都是由野生种驯化而来〔2〕。

3.2 杂交育种

品种间杂交可以创造基因重组的新类型，为选育新品种提供丰富的变异材料，在提高三叶草饲草和种子产量、改良品种和提高抗逆性等方面具有重要作用〔2〕。红三叶杂交种具有很大的生产潜力，但分离高配合力的亲本，以及昂贵的种子生产费用使其经济效益降低。种间杂交可以引进新基因增加多样性，最广泛的白三叶种间杂交计划是由Williams 和Verry〔13〕利用白三叶×库拉三叶草启动的，由肯塔基的Anderson等人、威尔士的Abberton等人和新西兰的Hussain以及William等人继续研究。

1978年，ElizabethWilliams〔45〕通过对高加索三叶草和白三叶的杂交胚进行离体培养，成功获得可在户外大量繁殖的杂交后代再生植株。1995年Meredith〔46〕利用杂交胚珠离体培养技术，使白三叶与高加索三叶草和白三叶的后代进行回交，成功获得1粒种子。高加索三叶草在引种试验中不仅表现出良好的抗寒性，其抗旱能力也值得重视，需要进行评价研究。在引进高加索三叶草的基础上，从2005年开始，国内很多学者〔47-49〕以蒙农三叶草1号为母本，白三叶为父本，通过杂交胚离体培养技术和一系列组织再生技术，获得了杂种F1代植株，并成功进行了营养扩繁，形成数量较多的植株群体。2012年黄帆等人〔50〕通过遗传学和分子标记(ISSR)的鉴定，结果证明了杂种F1是真实的杂交后代。白三叶和蒙农三叶草1号亲缘关系较远，杂交F1代高度不育。经过多年探索，蒙农三叶草1号与白三叶杂交后获得F1代植株的技术难题已被攻克，利用组培继代和杂交后代很强的克隆繁殖能力，蒙农三叶草1号与白三叶杂交后代能够进行长期实验室和田间保存。在蒙农三叶草1号与白三叶的杂种F1代培育的过程中，出现多叶型(4～5小叶)植株，经过进一步的研究，形成多叶型株系。邬娜等人〔51〕对亲本、多叶型株系和普通型株系的营养成分分析，发现杂种F1代普通型株系和多叶型株系的茎、叶各常规营养成分含量与母本蒙农三叶草1号相近；多叶型株系的茎粗脂肪含量高于普通型株系；普通型株系的水分利用效率低于多叶型株系和亲本。

3.3 多倍体育种

三叶草的多倍体育种工作始于20世纪50年代中后期，其中最有成效的是红三叶四倍体。在前苏联培育的红三叶为2n=4X=28。西欧以及美国等国家培育的红三叶是2n=4X=32。四倍体红三叶具有抗病、长寿、高产等优点。

用秋水仙素处理发芽种子或幼苗的方法是目前诱导四倍体红三叶的主要方法。1981年美国学者W.A.Parrott和R.R.Smith〔2〕采用2n配子的方法获得四倍体红三叶，还可用组织培养和体细胞融合等生物工程方法获得四倍体三叶草。四倍体栽培品种在鲜草产量、粗蛋白含量和持久性方面优越，并且通常具有比其二倍体祖先更高的抗病逆性〔52,53〕，但四倍体栽培品种中的纤维素含量不是很高。四倍体的主要缺点是它们的种子产量低。四倍体的分枝较少，因此通常每株植物产生较少数量的花序〔54〕。最常用获得四倍体的方法是通过秋水仙素、氧化亚氮(N2O)等化学试剂处理幼苗。秋水仙素可防止在有丝分裂细胞分裂过程中染色体分离，获得的这种四倍体称为有丝分裂四倍体〔55〕。

3.4 分子育种

在20世纪80年代和90年代，各种类型的分子标记，如限制性片段长度多态性〔56〕(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)〔57,58〕、微卫星(microsatellite)和单核苷所多态性(SNP)被发展起来。由于它们的丰富性和在植物基因组中的重要性，分子标记已经被广泛地用于种质评价、遗传作图、基于图谱的基因发现以及标记辅助的植物育种等方面〔59,60〕。分子标记已经成为农艺性状遗传操作的一个有力工具〔61,62〕。由2000年拟南芥基因组〔63〕和2002年水稻基因组〔64〕的全基因组测序开始，越来越多的植物的基因组已经或者正在被测序。生物信息学、基因组学以及各种组学领域的技术发展正在产生丰富的数据，这些数据在未来可能会引起植物育种的革命。

4 展望

据不完全统计，目前已选育出的各类三叶草品种约500余个。Williams〔19〕曾报道，早期多采用的是自然选择和混合选择育种法，培育适合当地自然条件的生态型。随着育种工作的开展，生态型逐步被各种育种途径选育的优良品种所代替。根据育种目标，采用适当的育种技术选育新品种，已经成为三叶草育种的主要趋势〔2〕。随着我国草地畜牧业的迅速发展，生态环境建设力度的加大，选育不同利用目的的三叶草新品种已成为经济社会和生产实践发展的当务之急〔2〕。现如今，尽管植物分子生物学研究进展迅猛，前景巨大，但在三叶草牧草育种中的应用却很少。随着基于DNA的分子标记的出现，染色体的广泛遗传图对于许多物种变得容易实现。我们认识到的基因组是高度相似的，这种相似性可以使我们能够在物种之间预测基因的位置。因此，可以通过将常规育种的方法与各种生物技术相结合来培育三叶草的品种资源，使我国三叶草育种工作步入新的阶段。