加速溶剂萃取测定禽肉中FF及FFA方法研究

王波，赵霞，谢恺舟，张跟喜，张涛，戴国俊

(1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009；3.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

氟苯尼考(FF)为甲砜霉素(TAP)的单氟衍生物，抗菌机理与甲砜霉素相似，对多数革兰氏阳性菌和阴性菌都有作用，属于广谱类抗生素[1].氟苯尼考作为新一代的氯霉素及甲砜霉素替代品，克服了氯霉素易产生耐药性和造成再生障碍性贫血的问题，且抗菌活性强于氯霉素和甲砜霉素，具有抗菌谱广，口服吸收好，体内分布广泛，生物利用度高，应用安全等特点，广泛用于畜牧生产和水产养殖中.然而繁殖毒性试验表明，氟苯尼考及其代谢产物氟苯尼考胺(FFA)具有一定的胚胎毒性，近年来常有报道畜牧养殖和水产养殖中过度使用FF，导致FF和FFA残留在动物性食品中，危害人体健康.因此对FF及FFA在畜禽、水产等动物性食品中的残留检测等研究开始受到重视[2-3].通常以氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量总和作为动物体内氟苯尼考的残留标示物.欧盟、美国、中国农业部规定了FF和FFA在家禽肌肉中的最大残留量(MRL)为100 μg/kg[4-6].

目前，氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留检测的方法主要包括：酶联免疫法(ELISA)[7]、液相色谱法(LC)[8-12]、气相色谱法(GC)[13-15]和液质联用法(LC-MS/MS)[16-20].这些检测方法中常见的提取方法包括液-液萃取(LLE)[8,16,18]、织物相吸附萃取法(FPSE)[11]、固相萃取(SPE)[15]、亚临界流体萃取(SFE)[17,21].但是，LLE法耗时长和试剂消耗多，且可能存在操作上的误差；FPSE法快速、试剂消耗少，但不适用于动物饲料等固体样品；SPE法需要使用昂贵的固相小柱、提取时间长；SFE法操作复杂，萃取时间长.

加速溶剂萃取法(accelerated solvent extraction，ASE)是一种自动化、可替代传统萃取方法的新型萃取技术，操作简单、快速，适合批量处理样品.目前，利用加速溶剂技术萃取动物源性食品中哌嗪[22]、二硝托胺及其代谢产物[23]等均有研究，但采用加速溶剂技术萃取禽肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的研究还未见报道.本试验以乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)为萃取溶剂，乙酸乙酯饱和的正己烷去脂，对禽肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺进行加速溶剂萃取，并采用超高效液相色谱-荧光检测法对禽肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺进行测定，确定最佳萃取条件，研究结果旨为动物源性食品中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留监测提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Waters ACQUITY FLD检测器(美国Waters公司)；ASE350加速溶剂萃取仪(美国Thermofisher公司)；ScanSpeedVac40离心浓缩仪(丹麦Telstar公司)；5810R台式高速冷冻离心机(德国Eppendof公司)；超纯水制备仪Smart2-Pure(美国Thermo Scientific公司)；Mettler Toledo FE20 pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；氟苯尼考标准品(纯度为99.0%，德国Labor Dr.Ehrenstorfer Gmbh有限公司)；氟苯尼考胺标准品(纯度为99.3%，德国WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof Gmbh有限公司)；乙腈(色谱纯，德国EMD Millipore公司)；三乙胺(色谱纯，纯度99.0%，赛默飞世尔科技有限公司)；磷酸二氢钠(纯度≥99.0%)、磷酸(纯度≥85.0%)、正己烷和氨水(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；十二烷基硫酸钠(纯度≥95.0%，分析纯，北京索莱宝科技有限公司)；试验用水为超纯水.

1.2 主要溶液配制

1.2.1 标准储备液配制 准确称取氟苯尼考标准品4.0 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶中，充分摇匀，配制成 400.0 mg/L标准贮备液.准确称取氟苯尼考胺标准品1.0 mg，先用1 mL超纯水溶解，再用乙腈定容至10 mL容量瓶中，充分摇匀，配制成 100.0 mg/L标准贮备液.将标准贮备液分装，密封，置-70 ℃超低温冰箱中，可稳定保存5个月.

1.2.2 提取剂配制 用移液器吸取10 mL氨水，用量筒量取490 mL乙酸乙酯至500 mL容量瓶中，配制乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)溶液，混匀备用.由于氨水易挥发，该溶液宜现配现用.

1.2.3 净化试剂配制 用量筒量取400 mL的正己烷至500 mL容量瓶中，加入适量的乙酸乙酯，混匀直至分层.

1.3 样品前处理

将鸡、鸭、鹅的胸肌肉分别通过匀浆机搅碎并充分混匀作为空白样品，分装，密封，置于-34 ℃冰箱中保存备用.准确称取2.0 g均质好的空白禽肉样品放于研钵中，与适量硅藻土研磨均匀，为了达到最佳的萃取效率，将样品与硅藻土研磨成粉末状，装入22 mL萃取池中(若池子留有空隙则用硅藻土填满)，放在加速溶剂萃取仪的机械臂上进行萃取，选用优化后的萃取剂乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)进行萃取，其萃取过程及参数如下：萃取压力为10.34 MPa，萃取温度为80 ℃，萃取时间为3 min，萃取溶剂用量约为40%的池体积，每个样品之间自动冲洗1次，氮气吹扫时间60 s，静态循环萃取2次，最后收集萃取液.将萃取液转移至50 mL离心管，置于50 ℃离心浓缩仪(转速为2000×g)上吹至近干，加入1 mL纯乙腈涡旋震荡溶解残渣，加入5 mL乙酸乙酯饱和的正己烷去脂，涡旋震荡1 min后静置5 min，弃去上层正己烷，然后将萃取液置于50 ℃离心浓缩仪上吹干.将浓缩干后的样品用2.0 mL流动相复溶，涡旋1 min，以12 100×g离心15 min，过0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)针式滤器，滤液供UPLC-FLD检测.

1.4 UPLC-FLD分析条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，100 mm×2.1 mm i.d.；流动相A：超纯水(含0.005 mol/L的NaH2PO4溶液、0.003 mol/L十二烷基硫酸钠和0.05%的三乙胺，用85% H3PO4调pH 至5.3±0.1)；流动相B：乙腈；等度洗脱：A∶B=65∶35(V/V)；检测器：荧光检测器，激发波长233 nm，发射波长284 nm；流速：0.2 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃.

1.5 方法参数验证

1.5.1 标准曲线的绘制、检测限和定量限的测定 用空白基质液稀释每个混合标准工作溶液配制相应的浓度点(FF：LOQ、20.0、50.0、100.0、200.0、300.0、400.0 μg/kg；FFA：LOQ、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/kg)，将每个混合浓度点依次由低浓度到高浓度进行UPLC-FLD检测分析.每个浓度点重复测定3次，取平均值.以FF和FFA在不同空白基质样品(鸡肉、鸭肉和鹅肉)中的浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，求出目标化合物在不同空白基质样品中的线性回归方程和相关系数.空白基质液逐级稀释FF和FFA的浓度进行UPLC-FLD分析，样品检测信噪比(S/N)为3和10时所对应的添加浓度分别作为FF和FFA在样品中的检测限和定量限.

1.5.2 样品回收率和精密度的测定 准确称取2.0 g均质好的空白禽肉样品，向其添加4个浓度点的FF和FFA(LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL)，根据ASE前处理方法提取、净化样品，每个浓度点设置6个平行，取10 μL进样进行UPLC-FLD检测.将测定FF和FFA的峰面积分别代入到不同基质的标准曲线中去，计算出分析物的浓度来评估方法的回收率.将回收率检测剩余的样品按4个添加浓度在同一天内相隔6 h后用同一标准曲线及同一仪器重复测定6次，求平均值，计算日内精密度.在测定回收率后相隔一天用同一仪器不同标准曲线重复测定6次，求平均值，计算日间精密度.

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

2.1.1 ASE参数优化 ASE使用的压力远高于将溶剂保持在其液态所需的阈值，改变压力对分析物回收率的影响很小，因此不需要进行压力调节，压力一般在10.34 MPa[24].本试验在10.34 MPa压力条件下，考察了不同萃取温度(40、60、80、100、120 ℃)和提取时间(1、2、3 、5 、8 min)对萃取效率的影响.

图1 温度对ASE萃取效果的影响Figure 1 Effect of temperature on ASE extraction

图2 时间对ASE萃取效果的影响Figure 2 Effect of time on ASE extraction

由图1、图2可知，80 ℃是最佳的萃取温度，3 min为最佳静态萃取时间，在此条件下可保证FF和FFA均有较高的响应值.

2.1.2 萃取剂的选择 在ASE提取条件下，比较了不同的提取剂乙腈∶氨水(98∶2，V/V)、乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)和乙酸乙酯∶乙腈∶氨水(49∶49∶2，V/V))对样品回收率的影响.当乙腈∶氨水(98∶2，V/V)作为提取剂时，由于乙腈的极性比较大，从肌肉基质中提取的内源性极性物质较多，对目标化合物检测干扰大，即使调节流动相比例，目标化合物与杂质无法分离，因此需要通过SPE小柱净化才能实现目标化合物与杂质分离.然而SPE小柱的选择与方法的开发过程使样品的前处理过程变得更加繁琐，且耗时、耗力、耗成本.当乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)和乙酸乙酯∶乙腈∶氨水(49∶49∶2，V/V)作为提取剂时，两种提取剂均能很好地提取目标化合物(表1)，但是相比添加乙腈的提取剂，乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)提取出来的杂质更少，对于目标物的检测干扰更小，同时乙酸乙酯很快就可浓缩干，而乙腈浓缩干所用时间是乙酸乙酯的3倍多，延长了前处理的时间，检测效率降低.因此，本试验最终采用了ASE方法，乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)作为提取剂，节约了前处理时间，适合批量萃取禽肉中FF和FFA残留.

表1 不同提取试剂对50.0 μg/kg氟苯尼考和氟苯尼考胺提取回收率的影响

2.2 UPLC-FLD的优化

2.2.1 激发波长和发射波长的确定 将添加浓度50 μg/kg FF和FFA的鸡肉、鸭肉和鹅肉样品基质液通过荧光扫描，进一步优化目标物质的检测波长，确定在本试验条件下的目标物质的最佳检测波长.最终选择激发波长233 nm，发射波长284 nm，在此波长下既保证了目标物的高响应值，又保证无杂质的干扰.

2.2.2 超高效液相色谱条件的优化 色谱分析中，色谱柱和流动相的选择与优化是实现目标物良好分离效果的关键.在已报道的文献中[8-12]，氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺在C18柱上均有良好的分离效果，因此本试验采用了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm).Xie K 等[8]的报道，以乙腈∶NaH2PO4溶液(0.01 mol/L，含0.005 mol/L十二烷基硫酸钠和0.10%三乙胺，用85%H3PO4调pH 至4.5)32∶68(V/V)为流动相，能够很好地分离鸡蛋中TAP、FF和FFA.在先前的研究基础上，本试验对离子试剂(十二烷基硫酸钠)、缓冲体系(磷酸盐-磷酸)、三乙胺的用量和pH进行进一步的优化.试验过程中比较了1、3、5和10 mmol/L十二烷基硫酸钠的用量，0、3、5、10和20 mmol/L的NaH2PO4的用量，0.01%、0.03%、0.05%和0.1%的三乙胺用量和不同的pH值对目标物所产生的影响.研究发现，随十二烷基硫酸钠用量的增加，FFA出峰时间后延，3 mmol/L的用量即可保证FFA出峰时间提前；随NaH2PO4用量的增加，FFA出峰时间也略有提前，但盐的使用对仪器有一定的影响，而且易造成色谱柱的阻塞，在兼顾FFA出峰时间在前面和维护仪器的条件下，选用5 mmol/L的用量；三乙胺的用量也会影响FFA的出峰时间，0.01%的用量可改善峰拖尾的现象，但随其用量的增加，FFA出峰时间提前，综合考虑，最终确定三乙胺用量为0.05%；pH对于FFA的响应值和出峰时间均有影响，在中性pH条件下，FFA出峰时间靠前，但FFA的响应值随着pH的降低逐渐增强、出峰时间逐渐后延，当pH为5.4时，FFA的响应值达到最高，再降低pH对其响应值影响不大，但出峰时间太靠后，延长检测时间，降低检测效率，因此，最终确定pH为(5.3±0.1).上述所有条件的改变对FF的影响不大.因此本试验最终选用水(含5 mmol/L磷酸二氢钠，3 mmol/L十二烷基硫酸钠，0.05%的三乙胺，调pH为5.3±0.1)∶乙腈=65∶35(V/V)作为流动相，等度洗脱能够很好的分离禽肉中FF和FFA.

图3 50.0 μg/kg FF和FFA标准品、空白鸡肉和空白鸡肉样品添加50.0 μg/kg FF和FFA色谱图Figure 3 Chromatogram of 50.0 μg/kg FF and FFA standards,blank chicken muscle and blank chicken muscle samples spiked at 50.0 μg/kg FF and FFA

2.2.3 色谱分离 在优化好的UPLC-FLD条件下，测定鸡肉中FF和FFA的保留时间分别为2.195和4.181 min，鸭肉中FF和FFA的保留时间分别为2.188和4.170 min，鹅肉中FF和FFA的保留时间分别为2.194和4.181 min，峰形好，且空白样品在此时间无干扰峰出现.以鸡肉色谱图为例，图3为50.0 μg/kg FF和FFA标准品、空白鸡肉、空白鸡肉样品添加50.0 μg/kg FF和FFA的色谱图.

2.3 标准曲线

在线性范围内，FF和FFA的线性关系良好，决定系数均大于或等于0.9992.FF在禽肉中的检测限和定量限分别在3.6 ～ 4.2 μg/kg和10.2～11.4 μg/kg之间；FFA在禽肉中的检测限和定量限分别在1.0 ～ 1.4 μg/kg和3.0～ 3.5 μg/kg之间.方法灵敏度高，可用于检测禽肉中FF和FFA残留分析.禽肉中FF和FFA的检测限、定量限、回归方程、决定系数和线性范围见表2.

表2 鸡、鸭和鹅肉中FF和FFA检测限、定量限、回归方程、决定系数和线性范围

2.4 添加回收率和精密度

禽肉样品通过上述样品前处理方法提取、净化后，按照1.5.2方法进行UPLC-FLD测定禽肉中FF和FFA的添加回收率和精密度.表3和表4分别是禽肉中FF和FFA的添加回收率和精密度.禽肉中FF的回收率为84.17%～98.42%，相对标准偏差均低于3.70%，日内精密度均低于4.41%，日间精密度均低于4.98%；禽肉中FFA的回收率为83.76%～97.49%，相对标准偏差均低于3.94%，日内精密度均低于4.91%，日间精密度均低于5.89%.

表3 鸡、鸭和鹅肉中FF的添加回收率和精密度(n=6)

*.最高残留限量.

*.Maximum residue limits.

*.最高残留限量.

*.Maximum residue limits.

谢恺舟等[25]报道了高效液相色谱荧光检测法测定鸡肉中的氟苯尼考及氟苯尼考胺残留，添加浓度在5～500 μg/kg，FF和FFA的添加回收率分别在79.3%～82.5%、80.5%～85.6%之间，相对标准偏差均低于9.5%，日内、日间精密度分别低于7.4%、11%.与谢恺舟等[25]报道的方法相比较，加速溶剂萃取技术提取禽肉中FF和FFA的回收率和精密度高，同时超高效液相色谱减少流动相的使用，大大缩短了检测时间.ASE/UPLC-FLD检测禽肉的FF和FFA方法的建立，适用于快速检测动物源性食品中FF和FFA残留.

3 结论

本试验首次采用加速溶剂萃取前处理方法对禽肉样品进行提取FF和FFA，建立了ASE/UPLC-FLD方法检测禽肉中FF和FFA残留，为动物源性食品中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留检测提供了新的技术手段.该方法灵敏、快速，满足欧盟、美国和中国农业农村部对氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺残留检测的要求.