基于栅藻延迟发光表征中药药性的方法学验证*

闵令圆,庞靖祥,杨美娜,周宝宸,荆绮,韩金祥△

(1. 济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院，济南 250020；2. 山东省医药生物技术研究中心 山东第一医科大学(山东省医学科学院)， 济南 250062)

1 引 言

中药药性之四气亦称四性，中国药典对所有的中药均进行了“药性”的描述，即寒、热、温、凉。但目前仍缺乏一种公认的对中药药性的量化指标。生物光子辐射，也称为超微弱生物发光(UPE),广泛存在于植物、动物、微生物与藻类中，强度较低[1]。目前，UPE测量用于评估氧化状态和用于表征人体光学状态等[2-3]。超微弱发光起源于生物系统内一个高度相干的电磁场,携带着生命系统内部的完整信息，这便是生物光子相干性理论[4-5]。我们发现中医药理论与生物光子相干性理论存在可通约性[6]，“气”与机体电磁辐射基本特征相一致，于是有研究提出可用生物光子相干性理论等现代理论及其技术转化中医药理论[7]。经过大量研究后发现，利用栅藻作为生物指示剂，加入中药煎煮液，测量其延迟发光动力学数据，将其延迟发光的平均强度 (IW) 与时间 (t) 进行线性拟合，得到的线性拟合方程斜率K可以定量化表征中药药性[8-11]。

利用栅藻作为生物指示剂来定量化表征中药药性，该方法具有操作简单、灵敏度高、易于获得等特点。 并且相比还原论的方法，运用生物光子相干性理论研究中药药性是以整体论为哲学思想，契合中医基础理论。为了进一步将该方法标准化，我们对栅藻的波动范围进行了优化，并参照中国药典中所规定的标准[12-14]，对其仪器背景噪声、精密度、稳定性、重复性、空白溶剂干扰等项目进行了相关检测，从而大大提高了栅藻延迟发光表征中药药性这一方法的准确性、科学性和可行性，也为建立一种符合中医药理论基础的药性评价体系与指标奠定了基础。

2 实验材料

生物指示剂：栅藻(Scenedesmus sp.)，编号 FACHB-933，购于中国科学院武汉水生生物研究所， 使用 BG11 培养基进行培养。栅藻批次1，2018年6月8日购入；栅藻批次2，2019年1月2日购入。

主要仪器设备：YPMS-2生物光子测量仪、PM20SP型光电倍增管高压电源、尤尼科紫外分光光度计、超净工作台、高压灭菌锅、智能光照培养箱、尚朋堂电陶炉、康舒砂锅、石英比色皿、ACCULAB电子天平、烧杯、250 mL量筒、50 mL离心管、锥形瓶、移液枪。

中药：黄芩，产地河北，购自山东建联盛嘉中药有限公司中药饮片厂。

3 实验方法

3.1 栅藻波动范围测定

栅藻混合液在波长680 nm下吸光度 (A) 与细胞浓度 (C) 的线性方程为C= (A×11.995+0.1502 ) × 106个/mL ( r2= 0.9766 )。实验中选取两个不同批次栅藻，控制其吸光度A=2.5(即C=3.0×107个/mL)

调节检测室温度为恒温20 ℃，调节生物光子测量仪YPMS-2至性能最佳状态，即制冷系统温度-21℃，高压1 348 V，保证仪器的最佳灵敏度和信噪比。将3 mL吸光度A=2.5的栅藻混合溶液转入石英比色皿中，放入YPMS-2生物光子测量仪的暗室内，进行激发延迟发光的检测。仪器设置为光源∶White-LED；测量点∶900；选择测量方法∶DL；测量时间∶1.000000；光照时间∶10；重复次数∶7。实验前后均进行仪器空箱噪声测量，保证前后测量数值无统计学差异，以确定仪器的稳定性及结果的准确性。并使用相同方法连续测量41～60 d内栅藻的延迟发光。

3.2 加入中药煎煮液的栅藻延迟发光测量

3.2.1中药煎煮液的制备 精确称量黄芩10 g, 置于煎煮锅中，再添加200 mL水，浸泡药材。30 min后，加热煎煮锅，定时15 min，功率2 200 w。液体加热至沸腾后，功率转为800 w，使用六层纱布过滤煎煮液。过滤后的煎煮液暂存于250 mL的烧杯中，将残渣重新放回砂锅中与新量取的200 mL水混合，煎煮方法同上。第二次过滤后将砂锅内的药渣除净，将两次获得的煎煮液混合后再次加入砂锅中，使用电陶炉2 200 w功率加热，煎煮液沸腾后改为800 w，浓缩至终体积50 mL(终浓度为0.2 g/mL)，转入50 mL离心管并冷却至室温后，4 ℃保存(第二天使用)。

3.2.2中药煎煮液的延迟发光测量 取100 μL中药煎煮液上清，加入至栅藻混合液中，吹打混匀后，转入YPMS-2生物光子测量仪的暗室内，进行激发延迟发光的检测。检测方法同3.1节。

3.3 数据处理分析[8]

使用软件Statistica 10.0处理延迟发光实验数据，运用式 ( 1 ) 进行“双曲”拟合，式 ( 2 ) 计算延迟发光平均强度(IW)，将IW与t进行线性拟合，得到相应的线性拟合方程。其中斜率K表征了栅藻在不同的液体环境中延迟发光的动力学演化行为，可表征样品性质。

I(t)=A×csch2(t/B+C)

(1)

IW=A×B/W×[cothC-coth (W/B+C)]

(2)

其中，A为强度参量，B为特征时间，C为位相因子，W为总的测量时间。

3.4 方法学考察

3.4.1仪器背景噪声 实验前后进行系统背景噪声的测量，选择背景测量，点间隔1 s，测量时间15 min，激发光源为White-LED，激发时间为10 s，连续测量10 d，实验前后背景系统噪声在一个光子差值内，认为仪器系统处于稳定状态，仪器精密度良好。

3.4.2精密度实验 取同一管黄芩煎煮液的上清按照3.2.2节方法连续进样检测7次，数据按照3.3节方法进行处理，若是7次试验K值的RSD<4%，则精密度符合要求。

3.4.3重复性实验 取同批次的黄芩7份，煎煮成药液后，取上清，按照3.2.2节方法连续进样检测7次，数据按照3.3节方法进行处理，若是7次重复试验K值的RSD<8%,则重复性符合要求。

3.4.4稳定性实验 取同一管中药煎煮液的上清，按照3.2.2节方法分别在0、4、8、12、24、48、72 h进样检测，数据按照3.3节方法进行处理，若是7次试验K值的RSD < 4%,则稳定性符合要求。

3.4.5空白实验 分别将空白溶剂(无菌水)100 μL和培养基BG11 100 μL加入到3 mL栅藻中，按照3.2.2节方法，连续进样检测7次，数据按照3.3节方法进行处理，若两者K值无显著性差异，表明空白溶剂对本实验没有干扰。

4 结果与讨论

4.1 栅藻K值波动范围测定

本研究通过测量栅藻作为生物指示剂使用时，其最佳生长阶段 ( 41～60 d ) 内的延迟发光数据，得到栅藻K值的波动范围，利用生物光子的手段，对栅藻的生长状态进行描述，并且优化栅藻的可使用范围。表1给出了不同批次的栅藻在41～60 d内的7次激发延迟发光的平均强度对时间的线性方程及线性拟合斜率K。我们发现两个批次的栅藻在20 d内的激发延迟发光斜率K比较稳定，波动较小，见图1，批次1与批次2没有显著差异，见图2，经过计算可知多次测量的K值符合正态分布，其中ρ=0.181，μ=3.3488，所以，根据置信区间[μ-3ρ,μ+3ρ]，得到栅藻K值范围为2.81～3.89。

表1 不同日期栅藻延迟发光K值对比

图2第41～60d不同批次栅藻激发延迟发光的平均强度对测量时间的线性拟合斜率K值比较

Fig.2Comparison of theK-value of different Scenedesmuscerevisiae batches on the41st to60th day

4.2 方法学考察

4.2.1仪器背景噪声 在实验前后分别检测仪器噪声发现，实验后的系统噪声比实验前的略小，实验前噪声平均值为10.68，实验后噪声平均值为10.04，相差不到1个光子，t检验结果发现并无统计学差异(P>0.05)，见图3，因此认为仪器系统处于稳定状态。

图3 连续10 d实验前后仪器系统噪声对比

4.2.2精密度实验 本研究测定了7次同一黄芩煎煮液的激发延迟发光的平均强度对测量时间的线行拟合斜率K，见表2，经计算其RSD≈3.78%。因为RSD<4%，故该检测方法符合精密度要求。

表2 同一黄芩煎煮液拟合斜率KTable 2 The fitting slope K-value of the same scutellaria decoction

4.2.3重复性实验 分别称量相同批次的黄芩10 g，连续7 d对其煎煮液进行测定激发延迟发光的平均强度对测量时间的线行拟合斜率K，见表3。对结果进行计算，7次K值得出的RSD ≈ 3.835% ，因RSD < 8%，故该检测方法符合重复性要求。

表3 同一批次黄芩煎煮液连续7 d的拟合斜率K

4.2.4稳定性实验 表4给出了生长阶段的栅藻在0、4、8、12、24、48 h的7次激发延迟发光的平均强度对测量时间的线行拟合斜率K，经过计算发现RSD ≈ 2.845%， 因RSD < 4%，故该检测方法符合稳定性实验检测标准。

表4 不同时间段激发延迟发光的平均强度对测量时间的先行拟合斜率K

4.2.5空白实验 为了避免中药煎煮液中的溶剂水对栅藻K值的影响，我们将加入空白溶剂水的栅藻作为对照组，将加入BG11培养基的栅藻作为空白组进行检测，实验结果表明，对照组与空白组之间无显著性差异(P>0.05)，见图4，说明了中药煎煮液中的溶剂水并不影响中药的药性检测。

图4 空白溶剂 ( H2O ) 与BG11的K值对比

5 结论

中药药性是中医药基础理论的重要组成内容，建立符合现代科学认知规律的中药药性表征体系及其规范标准是中药药性理论研究的关键科学问题，而寒热温凉四性是药性理论研究的重点之一[15]。基于生物光子相干性理论与中医药理论具有共同特征[16]，我们建立了以栅藻激发延迟发光的平均强度对测量时间的线性拟合斜率K定量化表征中药药性这一方法，符合中医整体观。

本研究进行了以栅藻作为生物指示剂表征中药药性的方法学验证，探讨了其仪器背景噪声、精密度、稳定性和重复性，并进行了空白实验，优化了栅藻的使用条件，获得了栅藻K值的正常波动范围为2.81～3.89，仪器适应性良好，连续10 d检测结果并无统计学差异，精密度实验RSD≈3.78% < 4%，重复性RSD≈3.835%<8%，稳定性RSD≈2.845%<4%。因此，栅藻激发延迟发光的平均强度对测量时间的线性拟合斜率K定量化表征中药药性这一方法是符合方法学验证要求。本研究建立的方法为中药药性的定量化研究提供了实验基础。