高效液相色谱法同时测定对氨磺酰苯甲酸3种有关物质

李金凤，杨祥龙，李 广，李秀梅，李庆娟

（瑞阳制药有限公司，山东 淄博 256100）

对氨磺酰苯甲酸（对羧基苯磺酰胺），是制备抗风湿药物丙磺舒的重要中间体，其制备主要是在不同条件下，对甲苯磺酰胺被氧化剂重铬酸钾或高锰酸钾氧化得到[1-2]。谢建英[3]报道可在微波辐射下，以双氧水氧化对甲苯磺酰胺获得。作为重要中间体，对其质量控制对最终产品质量有着至关重要的作用，特别是有关物质贯穿于整个药品研究的始终。根据其化学性质、合成路线确立了本品中可能存在杂质A、杂质B、杂质C。建立高效液相色谱同时对对氨磺酰苯甲酸中可能存在3种杂质的定量检测方法，并对其进行了详细的方法学研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津），梅特勒电子天平（瑞士梅特勒XS205）

1.2 试药

对氨磺酰苯甲酸原料（来源：AOCS；批号：ONS-007-29；含量：w=97.61%）；杂质A（来源：中国食品药品检定研究院；批号：100131-201603；w=100%）；杂质 B（来源：SINCO PHARMACHEM； 批 号 :17-07-1601； w=98.43%）；杂质 C（来源：SINCO PHARMACHEM；批号17-07-2201；w=96.76%）；杂质A,B,C的结构如图1。

图1 对氨磺酰苯甲酸及各个杂质的结构式

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.2 溶液配制

2.2.1 供试品溶液配制

称取约12mg对氨磺酰苯甲酸原料，精密称定，置25mL容量瓶中，用2.1项中流动相A溶解，定容摇匀，配制成浓度为0.48mg/mL的溶液，作为供试品溶液。

表1 两种不同溶液梯度洗脱表

2.2.2 杂质储备溶液配制

分别称取杂质A、杂质B及杂质C对照品各适量，精密称定，置于不同容量瓶中，用2.1项中流动相A溶解，定容摇匀，配制成各杂质浓度0.08mg/mL的溶液，作为对照品储备液。

2.2.3 系统性试验溶液

称取约12mg对氨磺酰苯甲酸对照品，精密称定，置于25mL容量瓶中，先加少量流动相A溶剂溶解，加0.750mL对杂质A储备液，加0.30mL杂质B、杂质C储备液，稀释、定容摇匀（杂质A 为2.4μg/mL、杂质B、C为0.96μg/mL）。

2.3 系统适用性试验

精密量取系统适用性溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图（图2）。对氨磺酰苯甲酸、间氨磺酰苯甲酸、邻氨磺酰苯甲酸、对甲基苯磺酰胺依次出峰，对氨磺酰苯甲酸与相邻峰之间的最小分离度为2.099＞1.5，故该方法的专属性比较强。

图2 系统适用性图谱

2.4 检测限和定量限

精密量取“2.2.2”项下对照品储备液逐级稀释后检测，当信噪比S/N不小于3且重复6次进样精密度的RSD≤15.0%时，确定次浓度为LOD，当信噪比S/N不小于10且重复6次进样精密度的RSD≤15.0%时，确定次浓度为LOQ。杂质A、B、 C 的 LOD（μg/mL） 结 果 ： 0.13、 0.068、0.044；杂质 A、B、C的 LOQ（μg/mL） 结果：0.18、0.11、0.060。杂质 A、B、C 的 RSD%（LOD，n=6） 分别为：4.26、11.11、11.04；杂质A、B、C的RSD%（LOQ，n=6） 分别为：10.69、4.36、3.06。

2.5 线性和范围

精密量取“2.2.2”项下对照品储备液配制成不同浓度的溶液，使浓度点在LOQ120%浓度范围内。以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标分别绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，用R2来证实良好线性关系。

1） 杂质 A：线性范围 0.18μg/mL～1.14μg/mL，线性方程 y=36813x-1828，R2=0.9962；

2） 杂质 B：线性范围 0.11μg/mL～1.14μg/mL，线性方程 y=60392x-1092，R2=0.9990；

3） 杂质 C：线性范围 0.26μg/mL～3.20μg/mL，线性方程 y=75085x+1951.4，R2=0.9982。

结果表明线性关系良好。

2.6 精密度

重复性精密量取供试品按“2.2.1”项下配制6批供试品溶液，分别进样，记录色谱图，计算6次样品中杂质A、杂质B、杂质C、总杂相对标准偏差 ，结果分别为：1.04%、0%、3.30%、0%。结果表明该方法重复性良好。

中间精密度精密量取供试品按“2.2.1”项下配制6批供试品溶液，分别进样，记录色谱图，计算中间精密度与重复性共12次测定结果杂质A、杂质B、杂质C、 和总杂的相对标准偏差，结果分别为：2.72%、0%、7.02%、4.21%。结果表明该方法精密度良好。

2.7 准确度

准确度是在供试品中加入各杂质对照品的80%、100%、120%三个不同浓度测得的回收率所得。精密量取供试品按“2.2.1”项下配制9份不同的供试品溶液，精密加入“2.2.2”项下杂质A、B、C的对照品储备液0.6/0.24/0.24mL、0.75/0.30/0.30mL、0.9/0.36/0.36mL共9份，定容，摇匀，配制成80%浓度 （1.92/0.768/0.768μg/mL）、100%浓度 （2.4/0.96/0.96μg/mL）、120%浓度（2.88/1.152/1.152μg/mL） 3个浓度的供试品溶液，另精密量取供试品按“2.2.1”项下配制供试品溶液一份作为本底校正溶液。分别进样，按面积归一法计算杂质A、B、C含量，扣除本底量后计算回收率。杂质A：平均值为96.50%，RSD=0.17%（n=9）；杂质B：平均值为98.68%，RSD=0.12%（n=9）；杂质C：平均值为99.38%，RSD=0.09%（n=9）；结果表明准确度良好。

2.8 样品测定

精密量取不同批次（批号：20171106/20171120/20180105）供试品按“2.2.1”项下配制溶液，量取各有关物质对照品按 “2.2.2”项与

“2.2.3”项下配制系统适用性试验溶液，按“2.1”方法进行检测，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如出现与对照品溶液中相应已知杂质保留时间一致的色谱峰，按面积归一法计算，其中三批样中均未检出杂质B、C；杂质A的检测结果分别为：0.31%、0.31%、0.31%；总杂分别为：0.31%、0.31%、0.30%。此方法适用于对氨磺酰苯甲酸的检测。

3 结语

本试验建立了同时检测对氨磺酰苯甲酸中3种有关物质的高效液相色谱法，并对方法的有效性和检出能力进行了评价[4]。结果表明，该方法简便、准确，可有效分离3个杂质并应用于批量检测，为以对氨磺酰苯甲酸为中间体的丙磺舒等原料提供质量保障。