基于SSR分子标记的糯玉米遗传多样性研究

杨亚桐　董安忆　刘松涛　Zenda Tinashe　段会军

摘要：为明确糯玉米自交系间的亲缘关系，利用19对简单重复序列（SSR）标记对32份糯玉米自交系进行遗传多样性分析，共检测到80个等位基因变异，每个位点可检测到2～7个等位基因变异，平均每个位点检测到4.21个。通过NTSYS聚类分析方法，在遗传相似系数为0.53处将32份糯玉米自交系划分为6个类群，分别包含3份、2份、11份、11份、2份和3份，其中亲缘关系较近的白糯6和突变体N17聚在了一起，3个杂交种（郑黄糯2号、石彩糯和京科糯）的父母本被划分在不同的类群中，进一步从分子水平上揭示了亲本种质的遗传差异与玉米杂种优势的关系，为玉米育种和改良奠定了理论基础。

关键词：糯玉米;SSR;遗传多样性;聚类分析

中图分类号： S513.032

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）02-0083-04

收稿日期：2019-01-14

作者简介：杨亚桐（1994—），男，河北河间人，硕士研究生，主要从事作物遗传资源与利用研究。E-mail：1539245869@qq.com。

通信作者：段会军，博士，教授，主要从事作物遗传资源与利用研究。E-mail：hjduan@hebau.edu.cn。

糯玉米（Zea mays L. var. ceratina Kulesh）是玉米属的一个亚种[1]，是普通玉米第9染色体短臂上的Wx基因发生隐性突变形成的一种蒸煮后呈糯性的突变体[2-3]，由于糯玉米籽粒干燥后胚乳呈角质不透明、无光泽的蜡质状，所以又被称作蜡质玉米[4]。根据糯玉米籽粒的颜色可以分为：白糯、黄糯、紫糯、黑糯以及彩糯等，其中白糯和黄糯较为常见[5]。糯玉米具有富含支链淀粉[6]、营养丰富和适口性良好等优良特性，现已成为深受人们欢迎的食品和工业原料，具有较高的经济价值。

SSR（simple sequence repeats，简单重复序列）又称为微卫星DNA[7]，是共显性分子标记，是建立在PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）基础之上的一种遗传标记，具有很高的多态性和覆盖率，测得结果的稳定性和重复性比较好，试验操作程序简单，对DNA的数量和纯度要求较低[8]。国内外研究学者在玉米遗传多样性方面做了大量的研究工作，李锐等利用SSR技术对来源于144份甜玉米群体的40个位点进行了分析，共检测到343个等位变异，每对引物测出4-17个等位变异，平均8.58个，SSR聚类分析将144份甜玉米群体划为7个类群[9];谷静丛利用28对SSR引物对110份普通玉米自交系进行遗传多样性分析，将其划分为六大类群，19个亚类群[10];Warburton等[11]、Reif等[12]的研究结果证实了利用SSR标记进行玉米遗传多样性及杂种优势群划分的可行性。

尽管SSR分子标记较普遍地应用于植物的遗传多样性研究上，但在糯玉米种质资源中的研究报道比较少。本研究利用SSR分子标记对32份糯玉米自交系进行遗传多样性分析，确定供试糯玉米自交系间的遗传背景差异，为糯玉米优良品种选育和杂种优势模式构建提供研究基础和理论依据。

1 材料與方法

1.1 材料

供试材料选自河北农业大学鲜食玉米课题组选育的26份糯玉米自交系，编号为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11、N12、N13、N14、N15、N16、N17（白糯6突变体）、N18、N19（石白糯1号）、N20、N21、N22、N23、N24、N25、N26和引进的国审糯玉米品种郑黄糯2号父母本（郑黄糯04、郑黄糯03）、石彩糯父母本（石糯1号、石糯2号）及京科糯父母本（白糯6、京糯6）。

1.2 方法

1.2.1 用CTAB法提取玉米叶片基因组DNA 将玉米种子浸泡1夜，播种（每个品种播3粒）;待玉米长到3～4叶时取叶提取玉米基因组DNA。具体提取步骤：（1）将无水乙醇放入-20 ℃冰箱中预冷，CTAB放入65 ℃水浴锅中预热1 h。（2）取新鲜玉米叶片加入适量已预热好的CTAB中研磨，分别装入1.5 mL离心管中，放入65 ℃水浴锅中水浴60～75 min。（3）从水浴锅中取出，加入等体积的氯仿异戊醇（24 ∶1）。使用摇床摇晃或用手上下翻转 20 min。（4）放入离心机中，10 000 r/min离心 10 min。（5）取上清液至新离心管中，加入等体积氯仿异戊醇，摇晃15 min。放入离心机中，10 000 r/min离心10 min。（6）取上清液至新的离心管中，加入 -20 ℃ 预冷好的无水乙醇至1.5 mL，缓缓摇晃，出现白色絮状沉淀（DNA），放入冰箱-20 ℃中冷却 5 min。（7）从冰箱中取出DNA，放入离心机中离心，10 000 r/min，10 min，弃上清液。（8）加入75%乙醇（75 mL 95%乙醇+20 mL蒸馏水）70 μL，将DNA弹起，摇晃10 min，充分洗涤DNA，放入离心机中 10 000 r/min离心2～3 min。弃上清，共洗脱3次。（9）将洗脱好的DNA开盖晾干，晾1夜即可，第2天可加去离子水溶解（100 μL）。（10）测量DNA浓度（放-20 ℃冰箱中保存）。

1.2.2 SSR引物 选用19对SSR引物（表1），由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR反应 20 μL PCR反应体系如下：cDNA 2.0 μL;Buffer 2.0 μL;上下游引物各1.0 μL;Taq DNA Polymerase 0.2 μL;dNTP 1.6 μL;ddH2O 12.2 μL。体系混合均匀后加1小滴矿物油（全过程在冰上进行）。

PCR程序为：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性 40 s，X ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，30个循环;72 ℃延伸5 min。10 ℃保温。注意X ℃退火，具体退火温度参考引物Tm值;扩增完成后，放入冰箱4 ℃保存。

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