Shc3高表达抑制人肝癌细胞系凋亡并参与肝癌耐药

张新然，张 弋，高慧儿，强兆艳，李咏梅

(1.天津市第一中心医院 药学部，天津 300192； 2.天津医科大学 基础医学院 药理学系，天津 300070；3.天津医科大学 基础医学院 病原生物学系，天津 300070)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是当今世界上最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，其病死率居于恶性肿瘤病死率第2位[1]。HCC多伴肝内或远处脏器转移，无法行根治性手术治疗，因此，药物是晚期肝癌患者治疗的主要手段之一。索拉非尼是晚期肝癌治疗的靶向药物，但由于药物获得性耐药问题致使肝癌预后并没有较大改善，HCC 5年生存率仅为5%～6%[2]。衔接蛋白Shc3(Src homolog and collagen homolog 3)隶属于Shc家族一员。既往研究结果发现Shc3在HCC组织中高表达，Shc3表达上调促进HCC转移[3]，然而，Shc3表达下调对HCC细胞凋亡的影响有待进一步研究。Shc3在生长因子刺激的神经母细胞瘤中可结合酪氨酸激酶受体，激活MAPK通路，抑制肿瘤细胞分化，促进肿瘤增殖[4]。半数早期和大部分晚期肝癌患者中MEK/ERK激活的患者预后相对较差[5-6]。结合索拉非尼的药理作用，其是一种有效的酪氨酸激酶抑制剂，因此，推测由Shc3介导的信号通路激活可能在索拉非尼耐药中发挥重要作用。本研究将探讨Shc3与HCC细胞凋亡及耐药性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂

胎牛血清、DMEM培养液(Hyclone公司)；Shc3一抗(Santa Cruz公司)；β-actin一抗(Immuno Way Biotechnology公司)；p-MEK、MEK、p-ERK、ERK一抗和索拉菲尼(Cell Signaling Technology公司)；Shc3和18s rRNA引物(苏州金唯智生物科技有限公司)；FastQuant RT kit反转录试剂盒(TianGen公司)；FITC Amexin V Apoptosis Potectin Kit (BD公司)；Cell Counting Kit-8(Dojindo公司)；人肝癌细胞系HCCLM3、HepG2 和Huh7均购自美国典型培养物保存中心(ATCC)；Shc3 稳定下调和稳定上调的HCC细胞系及其阴性对照细胞为本实验室留存细胞系[3]。

1.2 方法

1.2.1 Western blot 检测目的蛋白表达：蛋白裂解液超声裂解细胞，提取总蛋白并用Pierce BCA试剂盒测各样本蛋白浓度，吸取等质量蛋白加入终浓度1×SDS蛋白上样缓冲液煮沸10 min，采用10% SDS-PAGE胶每孔上样50 μg，室温电泳120 V，1 h，250 mA于4 ℃转膜90 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，第2天使用同源二抗室温孵育1 h，ECL发光液显色曝光。

1.2.2 Real-time PCR检测Shc3 mRNA表达：使用反转录试剂盒进行反转录反应。8联管中配置如下20 μL反应体系：cDNA模板200 ng，上下游引物以10 μmol/L的浓度加入1.2 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，用DEPC处理水补足至20 μL。荧光定量PCR引物序列见表1。将样品送入ABI 7500 Fast real-time PCR仪中，设定的程序为94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，进行40个循环。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequence of real-time PCR

1.2.3 凋亡实验检测细胞凋亡：正常消化细胞，用500 μL 冰PBS洗一次，4 ℃ 1 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，100 μL 1×结合缓冲液重悬细胞，所有实验组样本及FITC单阳样本加入5 μL amexin-V-FITC溶液，所有实验组样本及PI单阳样本加入5 μL PI溶液，室温避光静置15 min，最后加入100 μL 1×结合缓冲液在1 h内应用流式细胞仪检测结果。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖：96孔板每孔接种4×103个细胞，24 h后给药。Huh7细胞系组中索拉菲尼终浓度分别为1.25、2.5、5、10和20 μmol/L，HepG2细胞系组中索拉菲尼终浓度分别为2.5、5、10、20和40 μmol/L。加药组每个浓度设置5个重复，不加药DMSO组作为对照组。37 ℃，5% CO2条件下孵育48 h后，每孔加入100 μL CCK-8溶液(1∶10稀释)37 ℃孵育3 h，酶标仪检测450 nm波长处吸光度[7]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 人肝细胞癌系HCCLM3和HepG2细胞中Shc3下调效率

Shc3分别在HCCLM3和HepG2细胞中的mRNA和蛋白表达量较scramble组明显下调(P<0.05)(图1)。

2.2 Shc3表达下调促进HCCLM3和HepG2细胞凋亡

与scramble组细胞相比，Shc3低表达组细胞凋亡比例增加(P<0.05)(图2)。

2.3 Shc3表达下调降低HCCLM3和HepG2细胞中p-MEK、p-ERK蛋白表达

与scramble组细胞相比，Shc3低表达组细胞中MEK/ERK通路激活程度明显降低(P<0.05)(图3)。

2.4 Shc3表达上调增加Huh7和HepG2细胞对索拉菲尼耐受性

前期实验结果表明，Shc3在Huh7细胞中的表达量低于HCCLM3细胞[3]，因此在Huh7细胞中高表达Shc3。Shc3分别在Huh7和HepG2细胞中的mRNA和蛋白表达量较对照组pCDH细胞明显上调(P<0.05)。以不同浓度索拉菲尼分别作用细胞48 h后，随药物浓度递增两组细胞存活率均递减。但在同一药物浓度下，Shc3过表达组细胞存活率明显高于pCDH组细胞(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with scramble group图1 Real-time PCR和Western blot 检测Shc3在HCCLM3(A)和HepG2(B)细胞中下调效率

*P<0.05 compared with scramble group图2 凋亡实验检测Shc3表达下调对HCCLM3(A)和HepG2(B)细胞凋亡的影响

*P<0.05 compared with scramble group图3 Western blot检测HCCLM3(A)和HepG2(B)细胞中MEK/ERK通路蛋白表达情况

2.5 Shc3表达上调提高Huh7和HepG2细胞中p-MEK、p-ERK蛋白表达

与pCDH组细胞相比，Shc3高表达组细胞中MEK/ERK通路激活程度明显增强(P<0.05)(图5)。

3 讨论

Shc3与肿瘤的增殖、分化和转移等密切相关，在肿瘤中的研究相对较少，只在神经母细胞瘤和甲状腺癌中有报道[4,8]。在神经母细胞瘤TNB1细胞中，Shc3在被生长因子刺激的神经母细胞瘤中可结合酪氨酸激酶受体，结合后的Shc3构象变化激活MAPK通路，从而过表达Shc3抑制了细胞分化，低表达Shc3明显抑制了小鼠体内的神经母细胞瘤TNB1的成瘤性，从而抑制肿瘤增殖[4]； 在甲状腺癌FB2细胞中Shc3与Gab1结合从而招募PI3K的亚型p85 激活AKT通路，促进肿瘤的增殖[8]。前期研究结果发现，Shc3在HCC肿瘤组织中的mRNA及蛋白表达水平均高于相应癌旁组织，且Shc3高表达的HCC患者预后较差，体内和体外促进HCC转移[3]。本研究结果进一步表明，Shc3表达下调促进HCC细胞凋亡。

*P<0.05 compared with pCDH group

*P<0.05 compared with pCDH group图5 Western blot检测Huh7(A)和HepG2(B)细胞中MEK/ERK通路蛋白表达情况

MEK/ERK信号传导通路在HCC细胞中普遍激活，应用Ras抑制剂通过阻碍MEK/ERK通路治疗肝癌Hep3B、HLF和Hep40细胞株可诱导凋亡反应，抑制HCC增殖[9]。在食管癌KYSE 150 细胞中，MIR-133A可以通过靶向EGFR抑制MEK/ERK通路，从而促进细胞凋亡，提高放射治疗的敏感性[10]。本研究发现Shc3表达下调抑制MEK/ERK通路的激活，从而促进HCC凋亡，与报道一致。

索拉非尼是一种多靶点分子靶向药物，在抗肿瘤方面具有双重作用：一方面抑制MEK/ERK信号通路从而抑制肿瘤增殖；另一方面阻断肿瘤新生血管的形成[11-12]。在PLC/PRF/5 和HepG2肝癌细胞中，索拉菲尼抑制MEK和ERK磷酸化，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤增殖[13]。本研究发现，Shc3在Huh7和HepG2中表达上调激活了MEK/ERK通路，降低了对靶向药物索拉菲尼的敏感性。

综上所述，本文结合前期研究基础，从Shc3表达下调抑制MEK/ERK通路激活促进HCC细胞凋亡的角度，进一步证明Shc3过表达增加HCC细胞对索拉菲尼的耐药性并激活MEK/ERK通路，继而说明Shc3与肝细胞癌索拉菲尼耐药之间的关联，但具体的耐药机制有待进一步探究。本研究结果为靶向Shc3治疗肝细胞癌提供了理论依据和实验室基础。