LMNA突变体HEK293、C2C12模型的构建及其核纤层蛋白A/C亚细胞定位

谈丹丹，柴竞艳，刘建云，聂红兵，熊 晖，吴向斌*

(1.九江学院附属医院 神经内科；2.九江学院基础医学院，江西省系统生物医学重点实验室，江西 九江332000；3.北京大学第一医院 儿科，北京100034)

LMNA(lamin A)基因编码A型核纤层蛋白，主要为核纤层蛋白A/C。核纤层蛋白A/C在体细胞广泛表达，分布于细胞核内膜下层，是细胞核骨架的重要组成部分,参与核孔复合体与核膜蛋白的锚定、细胞核的运动与定位、DNA转录与损伤修复等重要过程[1-2]。LMNA-相关先天性肌营养不良(LMNA-related congenital muscular dystrophy, L-CMD)是一类由LMNA突变导致肌营养不良亚型[3]。L-CMD患者肌纤维结构严重破坏，肌细胞核形态显著异常，核内异染色质浓缩，可见核膜局灶缺失、核带、核仁裂，细胞核周围线粒体形态异常且排列紊乱[4]。机械应激致病假说提出：LMNA突变导致SUN1、Emerin蛋白、核纤层蛋白B1、核纤层蛋白B2等核内膜下蛋白发生表达与分布异常，使得细胞核脆性增加，增加了肌肉组织的机械应激[5]。基因调控致病假说认为：LMNA突变影响DNA损伤修复及基因表达调控[6]，导致肌细胞增殖及分化障碍。但是，核纤层蛋白A/C异常导致L-CMD发病的具体机制尚未完全明确。为进一步了解LMNA突变导致L-CMD的致病机制，本研究构建LMNA野生型与突变体真核表达载体，转染HEK293与C2C12细胞，构建细胞模型，进一步构建了LMNA突变体慢病毒载体，转染C2C12，为LMNA突变体功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞系HEK293(ATCC细胞库)；小鼠成肌细胞系C2C12(南昌大学第一附属医院神经内科洪道俊教授馈赠)；pEGFP-N1质粒(北京大学中心实验室)；含人类LMNA全长cDNA的质粒pEGFP-N1-LMNA及突变体质粒pEGFP-N1-LMNA-I373V(北京大学第一医院儿科实验室构建及保存)；Lipofectamine 2000、大肠杆菌菌株DH5α(Invitrogen公司)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)；限制性内切酶(Thermo Fisher Scientific公司)；无缝克隆试剂盒(BBI Life Sciences公司)；质粒提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；兔源核纤层蛋白A/C一抗(10298-1-AP)、羊抗兔耦联Cy3标记二抗(Proteintech公司)；Hoechst33342(HY-15559A)(MedChemExpress公司)。引物合成与基因测序、pHBLV-GFP-PURO慢病毒穿梭质粒、pSPAX2与pMD2G[明琛志远生物技术(北京)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 野生型全长LMNA cDNA和突变体真核表达载体的构建： 根据目的基因及载体序列设计扩增引物，构建pEGFP-N1-LMNA。PCR扩增LMNA cDNA的PCR反应条件：94 ℃预变性2.5 min，94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、68 ℃延伸2 min，共30个循环，68 ℃延伸5 min。将PCR产物及pEGFP-N1质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ进行37 ℃酶切3 h，混合于T4连接酶反应液中孵育1.5 h，转化感受态DH5α，克隆，质粒提取与测序鉴定。以pEGFP-N1-LMNA为模板，构建c.1117A>G定点突变质粒pEGFP-N1-LMNA-I373V。定点突变PCR反应条件：94 ℃预变性2.5 min，94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min，共20个循环，68 ℃延伸5 min。酶切、连接及转化感受态DH5α，克隆，质粒提取与测序鉴定。

1.2.2 质粒转染与G418抗性克隆筛选： HEK293与C2C12分别接种于24孔板，待细胞增殖至汇合70%时进行pEGFP-N1-LMNA、pEGFP-N1-LMNA-I373V质粒转染：A液为150 μL无血清DMEM+5 μL lip2000，混匀后静置5 min，B液为150 μL无血清DMEM+5 μg质粒DNA，A液和B液混匀，室温静置20 min，将混合液吸入24孔板，放于37 ℃、5% CO2培养箱培养，20 h后荧光显微镜下观察，利用GFP标记核纤层蛋白A/C，Hoechst33342标记细胞核。

C2C12细胞接种于24孔板，按上述方法进行细胞转染，转染16 h后换液，培养液含G418浓度为1 000 mg/L，10 d后细胞成簇增殖，运用极限稀释法挑取单克隆入96孔板继续G418筛选培养2周，转入24孔板扩大培养。利用GFP标记核纤层蛋白A/C，荧光显微镜下观察核纤层蛋白A/C亚细胞定位。

1.2.3 突变体慢病毒载体的构建： 以pEGFP-N1-LMNA-I373V为模板，上游引物F：5′-GGATCTATT TCCGGTGAATTCGCCACCATGGAGACCCCGTCCCAG C-3′，下游引物R：5′-TAAGCTTGGTACCGAGGATC CCGAGCTGCAGTTCTGGG-3′，进行PCR扩增，用EcoRⅠ、BamHⅠ酶切，胶回收的PCR片段与载体连接，转化感受态DH5a，37 ℃培养过夜。转化后平板挑菌，37 ℃ 250 r/min摇菌14 h，阳性克隆进行测序鉴定。pHBLV-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO慢病毒穿梭质粒、pSPAX2与pMD2G共转染293T细胞，转染后6 h更换为完全培养基，培养48和72 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，4℃ 2 000×g离心10 min，去除细胞碎片，然后收集病毒上清液，4℃ 82 700×g离心120 min，得到高滴度慢病毒超离液，进行慢病毒滴度测定。

1.2.4 慢病毒转染C2C12： C2C12细胞接种于24孔板，待细胞增殖至汇合70%时行慢病毒转染，准备6个1.5 mL离心管，第一个离心管中加入100 μL病毒液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度，再向每管加入适量DMEM配制成300 μL+4 μL慢病毒转染增强剂，分别加入对应孔，转染24 h后更换完全培养基，培养5 d，荧光显微镜下观察细胞绿色荧光信号良好。6 μg/mL嘌呤霉素筛选3 d，小部分细胞存活，绿色荧光信号强，运用极限稀释法挑取单克隆入96孔板继续2 μg/mL嘌呤霉素筛选培养2周，转入24孔板扩大培养。采用核纤层蛋白A/C特异性免疫荧光染色与Hoechst33342染色，观察核纤层蛋白A/C亚细胞定位及细胞核大小。

2 结果

2.1 野生型LMNA cDNA与突变体真核表达载体测序

对pEGFP-N1-LMNA与pEGFP-N1-LMNA-I373V融合质粒进行测序验证，测序结果与目的基因序列完全一致，c.1117A>G突变位点及周围序列(图1)。

2.2 质粒转染与核纤层蛋白A/C亚细胞定位

对转染的HEK293及C2C12进行免疫荧光观察，野生型质粒转染的细胞内核纤层蛋白A/C均匀表达于核膜下，突变体质粒转染的细胞内核纤层蛋白A/C表达于核中间，呈点状异常散在分布(图2)，C2C12转染效率(25%)明显低于HEK293转染效率(97%)(图2, 3)。pEGFP-N1-LMNA与pEGFP-N1-LMNA-I373V转染C2C12后继续G418筛选培养，免疫荧光观察G418筛选后的细胞内核纤层蛋白A/C亚细胞定位改变与瞬时转染基本一致(图4)。

2.3 慢病毒表达载体鉴定与滴度测定

pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO进行测序验证，测序结果与目的基因序列完全一致。对包装的慢病毒表达载体进行滴度测定，结果为pHBLV-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO：2×108TU/mL，pHBLV-GFP-PURO：1×108TU/mL。

Arrows showed the site of LMNA c.1117A图1 pEGFP-N1-LMNA与pEGFP-N1-LMNA-I373V中c.1117A位点及周围序列Fig 1 The sequences around c.1117A in pEGFP-N1-LMNA and pEGFP-N1-LMNA-I373V

A.HEK293 cells were transfected by pEGFP-N1; B.HEK293 cells were transfected by pEGFP-N1-LMNA; C.HEK293 cells were transfected by pEGFP-N1-LMNA-I373V; GFP-labeled lamin A/C

图2 野生型及突变体瞬时转染HEK293细胞
Fig 2 HEK293 cells were transfected by the wild and mutant constructs respectively

2.4 慢病毒载体转染C2C12细胞

pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO、pHBLV- GFP-PURO转染的C2C12细胞进行免疫荧光观察，pHBLV-GFP-PURO转染的细胞核大小一致、形态规则，核纤层蛋白A/C在核内均匀分布；突变体慢病毒转染的细胞核大小不一，核纤层蛋白A/C在核内分布不均匀(图5)。

3 讨论

LMNA定位于染色体1q21.1～21.3，主要编码核纤层蛋白A/C。核纤层蛋白A/C与多种核骨架蛋白连接，使核纤层蛋白、核内膜、核孔复合体紧密连接，发挥“脚手架”作用，参与形成细胞核-细胞质骨架结构[7]。LMNA导致的L-CMD在先天性肌营养不良中占4.2%～8.8%[8-10]。L-CMD肌肉病理呈肌营养不良样改变或肌肉病样改变，伴大量炎症细胞浸润，电镜下肌细胞核形态异常、核膜损害、肌纤维结构破坏[11]。

曾报道了一例LMNA c.1117A>G杂合突变导致的L-CMD呈炎性反应肌病样改变，电镜下显示肌细胞核损害。为进一步研究此突变导致L-CMD的发病机制，构建了野生型pEGFP-N1-LMNA、突变体pEGFP-N1-LMNA-I373V融合质粒。由于核纤层蛋白A/C在各组织细胞广泛表达，且HEK293细胞转染效率高，本研究选取HEK293进行突变体功能的初步研究。考虑HEK293不能完全解释L-CMD中肌细胞损害机制，进一步选择了目前常用于遗传性肌病研究的肌细胞系C2C12来构建突变体细胞模型。

A, B, E, F.C2C12 cells after transfecttion with pEGFP-N1-LMNA; C, D, G, H.C2C12 cells after transfecttion with pEGFP-N1-LMNA-I373V; GFP-labeled lamin A/C, nucleus were stained by Hoechest33342；I373V -1，I373V-2.wild type-1 and wild type-2 were two different visual fields of the same sample

图3 野生型及突变体瞬时转染C2C12细胞
Fig 3 C2C12 cells were transfected by the wild and mutant constructs respectively

A.C2C12 cells after transfecttion with pEGFP-N1-LMNA selected with G418; B, C. C2C12 cells after transfecttion with pEGFP-N1-LMNA-I373V selected with G418; GFP-labeled lamin A/C

图4 G418筛选后的野生型与突变体质粒转染的C2C12细胞
Fig 4 C2C12 cells were transfected by the wild and mutant constructs selected with G418

正常情况下，核纤层蛋白A/C均匀分布于细胞核内膜下层。突变体转染的HEK293与C2C12细胞均显示核纤层蛋白A/C在细胞核内呈散点样分布，表明LMNA突变导致核纤层蛋白A/C亚细胞定位改变。C2C12细胞转染效率明显低于HEK293，用G418筛选转染后的C2C12，荧光观察突变体转染的C2C12细胞核大小不一、形态不规则，核纤层蛋白A/C在核内散点样分布，结果与瞬时转染一致。但随着细胞传代，荧光亮度逐渐减弱，提示转染细胞内核纤层蛋白A/C表达逐渐下降。为提高C2C12转染效率及稳定表达突变的蛋白，进一步构建了突变体慢病毒载体转染C2C12细胞，免疫荧光染色结果与质粒转染一致，且转染效率明显提高，核纤层蛋白A/C表达更稳定，提示慢病毒比pEGFP-N1质粒更适合用于LMNA突变体C2C12模型构建。

A, B, C.C2C12 cells after transfecttion with pHBLV-GFP-PURO; D, E, F.C2C12 cells were transfected by pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO; red was immunafluorescence staining using 10298-1-AP; GFP-1,GFP-2.transfection of lentivirus labeled by GFP, cells of GFP-1 group were treated by immunaluorescence as A and D, cells of GFP-2 group with 100% confluence were untreated by immunafluorescence

图5 慢病毒转染的C2C12细胞
Fig 5 C2C12 cells after transfection with the lentivirus

本研究证实了LMNA c.1117A>G突变可导致细胞核形态改变及核纤层蛋白A/C核内定位异常。目前认为，LMNA突变导致核纤层蛋白A/C在肌细胞核内错误定位，继而改变核膜蛋白网络及细胞骨架结构，导致肌细胞与细胞核机械应激增加，使肌细胞坏死与凋亡增加[5-6]。研究表明，炎性反应机制可能是L-CMD发病的重要机制[12-13]。最新研究发现，L-CMD模型鼠的肌肉病理呈炎性反应肌病样改变，符合L-CMD患者炎症反应肌肉病理改变特点[14]。目前，肌细胞核畸形与炎性反应之间如何相互作用仍不明确。构建L-CMD细胞模型进行LMNA突变功能研究，有助于深入认识L-CMD的致病机制，可能为该病的治疗研究提供新思路。